血管内皮生长因子对羊早期胚胎体外发育过程中印迹基因表达的影响和作用机理研究

本研究是在前期国家自然科学基金的结果上提出的，是相关研究的持续、深入和探索，所涉及的VEGF研究内容在该领域属国际前沿。从表观遗传学水平出发，通过RNA干涉、western blot、免疫组化、RT-PCR、限制性片段长度多态性分析法(RFLP)、ELISA、亚硫酸氢钠测序法等技术，深入探讨VEGF对羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育过程中对Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt1o的mRNA 和蛋白表达；印迹基因Igf2R、Peg1、Snrpn、H19 mRNA 表达；印迹基因Igf2R、 Peg1、Snrpn、H19印迹表达和转录活性的影响，并与体内羊早期胚胎相比较。深入研究VEGF在促进羊卵母细胞体外成熟和胚胎体外发育过程中对印迹基因和Dnmt家族表达的影响、各个基因印迹和Dnmt家族表达与较高卵母细胞成熟率和胚胎发育率之间的关系，以及与体内环境下各基因印迹表达和Dnmt家族表达的差异。

项目按照计划基本完成了大部分试验内容,具体结果如下:1.采用电转染方法，将针对血管内皮生长因子（VEGF）两受体FLT1和KDR各设计的3条双链小RNA干扰片段导入到颗粒细胞内。通过比对颗粒细胞生长曲线变化及检测FLT1和KDR在颗粒细胞生长过程中mRNA表达变化，从中筛选出能有效干扰FLT1和KDR mRNA表达的两条干扰片段。2.通过外源添加 VEGF及显微注射两有效干扰片段，采用实时荧光定量PCR对三种不同体外培养方式（COCs培养、裸卵培养、卵母细胞与颗粒细胞共培养）的卵母细胞生长发育过程中印记基因、DNMT家族以及VEGF和其两受体mRNA的表达进行检测。结果表明COCs的培养方式下添加VEGF比不添加DNMT1、DNMT3a的表达量低。而在裸卵培养条件下DNMT1的4h和18h表达量要都高于裸卵与颗粒细胞共培养的条件下的，且变化幅度略大，DNMT3a则相反。只单纯添加VEGF可以令DNMT1的4h和18h、DNMT3a的4h表达量在裸卵和裸卵与颗粒细胞共培养条件下减少。添加VEGF和其一种干扰片段比同时添加两种干扰片段对DNMT3a表达量的影响作用要大，尤其是在裸卵培养条件下这一作用更明显。无论何种形式DNMT3b表达量18h的低于4h的，裸卵条件下的DNMT3b 4h和18h表达量略高于裸卵与颗粒细胞共培养条件下的。VEGF添加及其干扰片段导入与否对H19、PEG1/MEST表达无影响，而IGF2R表达量18h的显著低于4h的，SNRPN则相反。在裸卵条件下的各处理方式IGF2R、SNRPN表达量低于裸卵与颗粒细胞共培养条件下的。添加VEGF和干扰片段有效的减少了IGF2R、SNRPN表达量，影响显著。3.VEGF能够明显地影响卵母细胞和颗粒细胞内VEGF、FLT1以及KDR的mRNA表达，对于其他DNMT家族和印迹基因mRNA在颗粒细胞中的表达未产生明显影响。4.采用westernblot研究COCs培养和共培养中卵母细胞VEGF、FLT1和KDR蛋白表达的影响。结果表明：FLT1的干扰片段加入使得FLT1蛋白量有所下降。VEGF的外源添加还会导致卵母细胞中KDR含量的上升，但效果不显著。卵母细胞中KDR的合成对颗粒细胞的依赖性较小。对FLT1进行干扰则会导致KDR含量的逐步上升；对KDR的干扰则显著地降低了KDR在卵母细胞中的表达。