母猪卵巢早衰相关miR-148a功能鉴定与分子调控机制研究

In mammals, the dormancy, persistence, and size of primordial follicles pool determine the length of reproductive life. The premature activation of primordial follicles before the natural aging leads to the premature ovarian failure (POF), which decreases the sow longevity and increases the cost sharply. The former work showed that miR-148a, expressed differentially in POF and prepuberty porcine ovaries, might be related to porcine POF. Based on this, the spatio-temporal expression of miR-148a will be identified through situ hybridization and qRT-PCR. The biological function of the miR-148a will be identified with the over-expression and LNA-expression in the cultured porcine oocytes or granulosa cells which will be used for the ovarian aggregation. The potential target genes of the miRNAs will be verified by bioinformatics analysis, construction of Sensor-report vector, and Western-blot, then the signaling pathway of the target genes will be elucidated. The results of this project will provide useful information for the interpretation of the porcine POF. And the work will benefit to the gilt breeding and determination of reproductive performance in earlier time. Also, the project will provide useful clues for the investigation of the ovarian miRNA regulation in human POF.

卵巢原始卵泡的静止、储备和数量决定了哺乳动物繁殖年限的长度。原始卵泡受到过早激活，引起卵巢早衰（premature ovarian failure，POF），导致母猪繁殖年限下降，增加养殖成本。前期生物信息学预测及实验表明，在POF卵巢与青春期前母猪卵巢差异表达miR-148a与POF密切相关。在此基础上，首先通过原位杂交和RT-PCR检测miR-148a时空表达规律；然后通过超表达和抑制表达，在细胞或者组织水平，鉴定miR-148a生物学功能；通过Western blot、Sensor-report载体构建验证miR-148a靶基因，并深入分析靶基因潜在信号调控网络。研究结果将为阐明母猪POF分子机制积累重要资料；为母猪早期选育和繁殖性能的标记辅助选择和早期选育提供遗传学依据，对降低生产成本具有潜在的重要意义；对于研究生殖相关miRNA调控途径及人类POF具有借鉴意义。

前期发现miR-148a、miR-196b-5p、miR-34c可能与母猪卵泡储备激活相关，为母猪POF的候选miRNA。通过qRT-PCR、细胞培养、超表达和抑制表达、Western-blotting等技术，研究3个miRNA与卵巢功能，获得如下结果：.（1）成功培养猪卵巢颗粒细胞。颗粒细胞经FSHR免疫荧光鉴定为阳性，且纯度高，培养48 h时，处于S期的细胞比例最高，占36.73%；在培养的1～4天为对数生长期，细胞活力高，可以用于后续试验。.（2）miR-148a影响猪卵巢颗粒细胞功能及靶基因验证：超表达miR-148a后，采用CyQUANT Cell Proliferation Assay法和Annexin V/PI法检测miR-148a在24 h到36 h之间促进可促进细胞的增殖，随着转染时间延长，猪颗粒细胞开始凋亡；干扰miR-148a后，细胞凋亡不明显。Sensor-report实验验证miR-148a靶基因为ESR1。.（3）miR-196b-5p功能研究.在分子水平，miR-196b-5p负调控靶基因p27和BCL11A；miR-196b-5p启动子受转录因子PPARg的正调控和p65的负调控。在细胞水平，miR-196b-5p通过靶基因p27及其下游的细胞周期蛋白和激酶CDK1、CDK2、cyclin A、cyclin B1和凋亡蛋白酶Caspase-3实现对细胞周期和原始卵泡的调控。在组织水平，卵巢中miR-196b-5p内平衡的破坏，导致新生小鼠原始卵泡的闭锁和耗竭；导致2月龄小猪卵巢原始卵泡的激活，可能是发育卵泡缺乏卵丘-卵母细胞复合物结构而引发卵泡闭锁。.（4）miR-34c的功能研究.在分子水平，miR-34c负调控靶基因FoxO3a；miR-34c启动子受P53、P50/P65正/负调控。在细胞水平，miR-34c促进颗粒细胞凋亡及细胞凋亡基因Bax/Bcl和Caspase-3的表达，抑制颗粒细胞增殖及细胞增殖基因PCNA的表达；FoxO3a能够抑制颗粒细胞凋亡并抑制颗粒细胞增殖，与miR-34c调控颗粒细胞表型相反；FoxO3a能够回复miR-34c引起的功能变化。.上述结果为深入研究miRNA通过调控颗粒细胞功能进而调节原始卵泡储备与激活与积累了重要的资料，对于揭示人类卵巢早衰分子调控机制具有很好的借鉴意义。.