百合体细胞胚发生过程中关键miRNA与靶基因的网络调控研究

Somatic embryogenesis is vital to the germplasm preservation, genetic traits improvement and gene regulation for bulb propagation as well as plant development in Lilium. And miRNA plays an important role as a transcription regulator in the somatic embryogenesis. However, the regulation pattern and molecular mechanisms of miRNA remain largely unknown as yet. On the basis of our previous work that establishing the somatic embryogenesis system in Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor, we have initially confirmed that there was some specific regulatory network in somatic embryogenesis on Lilium. In this project, seven kinds of typical culture during embryogenic transformation, embryogenic keep as well as embryogenesis were adopted. Firstly,we plan to combine Illumina sequencing with RT-PCR to identify the key miRNA, and use qRT-PCR to verify its expression pattern. Then based on the bioinformatics predict the corresponding target genes, and through the expression profile analysis show the expression differences. Finally,using the miRNA transgenic overexpression and 5'RACE technology, to explore the function and regulation mechanism of key miRNAs and the target genes in the process of somatic embryogenesis of Lily.The targets of the experiments are digging the key genes in somatic embryogenesis and lay a foundation for making clear the molecular mechanism of somatic embryos in lily, furthemore, providing theoretical and practical basis for realizing the artificial regulation of somatic embryogenesis.

体细胞胚发生对于百合种质保存、遗传性状改良、种球繁育及植株发育等的基因调控均具有重要意义，而miRNA作为调控因子在胚胎发生过程中起重要作用，但miRNA调控植物体细胞胚发生的模式和分子机制尚不明确。本研究在已建立细叶百合和兰州百合体细胞胚发生体系并初步证实百合体细胞胚发生可能存在特异miRNA调控网络的基础上，选取胚性转化、胚性保持和体胚发育3个关键阶段的7类典型培养物，通过Illumina测序结合RT-PCR分析鉴定关键miRNA，并采用qRT-PCR验证其表达模式；再以生物信息学方法预测miRNA对应靶基因，并通过表达谱分析揭示其差异表达情况；最后利用miRNA转基因过表达及5'RACE技术，探索百合体细胞胚发生过程中关键miRNA和靶基因的功能及其调控机理，以期为深入挖掘体细胞胚发生的关键基因奠定基础，并为最终明确百合体细胞胚发生的分子机制、实现体细胞胚发生的人工调控提供理论依据。

体细胞胚发生对于百合种球繁育、遗传性状改良、植株发育调控以及种质资源保存等具有重要意义，而miRNA作为调控因子在胚胎发生过程中起重要作用。本项目主要获得以下研究结果：1.百合体胚发生存在外起源和内起源两种方式，外起源方式的球形胚起源于外表层或亚表层细胞；内起源方式的球形胚均起源于内层细胞，在随后发育中分为始终包埋于内层细胞、突破内层细胞或突破外表层细胞3种类型；对不同阶段胚性培养物检测表明，百合体胚发生伴随活跃的碳水化合物代谢。2.两种百合的胚性细胞均在体胚诱导的第9 d以外起源方式发生，而兰州百合和细叶百合的内起源发生分别在体胚诱导的第12 d和第15 d，且伴随着较高的内源生长素含量，确定该时间节点为关键基因挖掘及功能研究奠定了基础。3.两种百合miRNA家族保守性均分为高、中、低度保守和特异性四个等级。兰州百合鉴定得到314个已知miRNA分属于超过47个家族和46个新miRNA，其中273个已知miRNA和40个新miRNA获得靶基因；细叶百合鉴定得到452个已知miRNA分属于超过86个家族和28个新miRNA，389个已知miRNA和18个新miRNA获得靶基因；260个已知miRNA为两种百合共有；与已知miRNA相比，新miRNA相对表达量较低。4.筛选并首次利用保守miRNA作为miRNA荧光定量表达检测的最适内参，兰州百合和细叶百合分别为lda-miR162和lpu-miR159a；5.对两种百合体胚发生中差异表达的24个miRNA和12个靶基因进行了表达模式研究和初步功能分析：细叶百合miR394a和miR528a分别对应靶基因BGA6和SSG参与碳水化合物代谢，兰州百合miR167、miR397和miR408分别负调控靶基因WRKY、LAC参与调控胚性细胞分裂和细胞壁木质素合成，两种百合miR395和miR396均分别对应调控FtsZ和GRF参与胚性愈伤组织和子叶形胚形成。6.优化了基于体胚发生的百合遗传转化技术体系，构建了基因编辑技术体系；创制了两种百合的4倍体新种质。7.筛选并克隆了ABCB亚家族和ARF家族相关基因的全长cDNA，构建了过表达载体，为探究生长素信号调控百合体胚发生的分子机理奠定了基础。综上，本研究初步构建了百合体胚发生相关miRNA调控网络，为明确其体胚发生机制奠定了基础。