狂犬病病毒感染潜伏期机体免疫应答的分子机制研究

Rabies virus (RABV) is neurotropic and an incubation period of several days to years exists before the viruses reach the central nervous system and form an irreversible infection. Research showed that RABV virulent isolates did not stimulate protective immune response obviously while the attenuated ones could stimulate the body to produce higher level neutralizing antibodies which cause it could not form a lethal infection. Clarifying the molecular mechanism of the immune response differences is the basis of revealing RABV infection process and the theory premise of blocking infection and treating rabies. In author's laboratory, the preliminary studies have been performed about the immune response regularity, tissue protein and serum protein expression differences after virulent and attenuated RABV isolates infection. In this study, based on the previous research, some different virulent RABVs will be infected mice and dogs, and in the incubation period, the peripheral and central immune cells, the immune factors and immune-associated proteins will be analysis quantitatively. The change regular and characteristic of inherent and adaptive immune-associated markers will be analyzed and compared in order to clarify the molecular mechanism of the body's immune response differences and establish the theoretical basis for rabies early diagnosis and treatment.

狂犬病病毒（RABV）具有嗜神经性，在其进入中枢神经系统形成不可逆感染之前，需经历数日至数年的潜伏期。研究表明，RABV强毒在潜伏期内并不刺激机体产生明显的保护性免疫应答，而弱毒可刺激机体产生较高水平的中和抗体，导致其不能形成致死性感染。阐明上述免疫应答差异的分子机制是揭示RABV感染过程的基础，也是从分子水平阻断感染和治疗疾病的理论前提。本实验室对RABV强弱毒株感染的免疫应答规律、RABV感染后中枢神经系统蛋白表达及潜伏期血清蛋白表达差异进行了前期研究，积累了大量数据。本研究拟在前期研究基础上，以不同毒力的RABV感染小鼠及犬，对潜伏期外周及中枢的免疫细胞、免疫因子及蛋白质组进行定量分析，对比不同病毒感染后3周内固有免疫及适应性免疫应答相关标志物的变化特点，解析其变化规律，进而阐明RABV感染潜伏期机体免疫应答差异的分子机制，为狂犬病感染机制的阐明和早期诊断及救治奠定理论基础。

狂犬病病毒街毒不论最初感染发生在机体哪个部位，最终都将通过感染局部侵入外周神经然后逆轴突转运至中枢神经系统（CNS），发生严重的脑脊髓炎引发动物死亡，而弱毒株弱毒株侵入机体，将在体内停留一段时间后于感染局部被清除，如果抵达CNS，将被瞬间消灭。RABV强弱毒株产生完全不同的感染结局，其毒力差别是造成这一结果的初始因素，而机体针对不同毒力RABV的应答差异则是决定感染结局的关键因素。. 本研究以代表性狂犬病街毒和弱毒各1株为研究对象，其中街毒株BD06系本室2006年从保定一狂犬脑内分离得到，为中国I群，代表目前我国狂犬病流行的优势毒株；弱毒株SRV9，源自1935年从狗分离到的SAD株，经连续动物传代及细胞驯化后致弱，目前已开发为疫苗株在全球多地应用。本研究以上述狂犬病病毒街毒株及弱毒株分别感染小鼠，对感染后脑组织进行数字化基因表达差异分析（DGEs），Go富集及信号通路分析，研究街毒和弱毒株外周感染后免疫应答的差异及差异因子涉及的通路，并对潜伏感染中差异表达的基因进行克隆，以慢病毒为载体对差异基因参与RABV感染与复制的过程进行研究。. 我们比较了两种感染途径病毒感染潜伏过程中机体对于RABV强弱毒株的差异应答，研究发现，病毒一旦形成感染，SRV9能够被RIG-I及TLR信号通路识别，诱导固有免疫应答，从而对病毒复制进行干扰，随后激活的适应性免疫应答将病毒进行清除；而BD06感染时，病毒“隐蔽”起来，逃逸模式识别受体（PRRs）的识别，少量病毒抵达中枢神经系统经潜伏一段时间后，病毒载量出现急剧增加，诱发CNS的“风暴”应答，而此时机体产生的痕量VNA又不足以完全清除RABV，感染小鼠出现四肢瘫痪、嗜睡、共济失调等临床症状，但病理结果显示CNS细胞结构完好，机体衰竭死亡。细胞水平上，通过拯救出表达IFITs（IFIT1、IFIT2、IFIT3与IFIT5）的慢病毒分别与RABV共感染细胞，结果表明IFIT3能够显著抑制RABV的复制，同时对于弱毒SRV9抑制效果比BD06效果更明显，而其他IFITs未检测到对RABV感染293T细胞有影响（不具有统计学差异），IFIT3抑制RABV强弱毒株效果的差异对于控制RABV街毒株感染提供一潜在的靶标。