中华按蚊感染疟原虫后高表达热休克蛋白40鉴定及功能研究

疟疾是世界上流行最严重的热带病之一。从分子水平阐明疟原虫与蚊虫宿主的相互作用机制，对于构建降低媒介能量或不传播疟原虫的转基因蚊虫，有重要意义。中华按蚊和斯氏按蚊对约氏疟原虫的易感性有明显差别。在前期筛选中华按蚊消减杂交cDNA文库鉴定并全长合成热休克蛋白40（hsp40）cDNA基础上，进一步鉴定hsp40基因组成，用基因组步移法扩增上游序列，比对、分析翻译起始点、序列一致性等；对可能的启动子用荧光素酶报告基因鉴定。由于hsp70和 hsp40共表达协同发挥许多重要的生理功能，分析蚊虫感染疟原虫后不同时间hsp40和hsp70 mRNA水平以及Hsp40蛋白在组织中分布情况，用RNAi干扰技术将shRNA导入蚊虫致hsp40基因表达沉默，观察对蚊虫疟原虫感染率，进一步确定hsp40抑制疟原虫在蚊体内的发育作用。研究hsp40基因在疟原虫感染免疫中的作用，可为通过防制疟疾提供候选靶分子。

疟疾是世界上流行最严重的热带病之一。从分子水平阐明疟原虫与蚊虫宿主的相互作用机制，对于构建降低媒介能量或不传播疟原虫的转基因蚊虫，有重要意义。疟原虫在蚊体内的发育极其复杂，大部分的疟原虫只在极少的按蚊中传播。实际上，全世界422种按蚊中，只有40种是疟原虫重要的媒介。不同种之间传播疟疾的能力有所不同。这种差异可能是蚊虫的生理和生化因素综合作用的结果，他们在不同的蚊种中表达不同。目前认为蚊虫的免疫系统对疟原虫的生长起着重要的调节作用。大多数结果都是来源于冈比亚按蚊基因组测序。.中华按蚊和斯氏按蚊对约氏疟原虫的易感性有明显差别。前期筛选中华按蚊消减杂交cDNA文库，发现热休克蛋白40（hsp40）表达上调，并全长合成热休克蛋白40cDNA，进一步研究hsp40基因在疟原虫感染免疫中的作用，可为通过防制疟疾提供候选靶分子。.本研究选用对约氏疟原虫易感的斯氏按蚊模型，构建消减杂交文库，筛选差异基因，进行生物信息学分析，并与相对不易感的中华按蚊感染疟原虫筛选的差异基因相比较，寻找两者之间的差异。从构建的正向文库得到54条序列，反向文库得67条序列。将所有序列与NCBI/tblastx/ESTs做同源性搜索，结果显示两个文库中有51条序列可以找到相似度较高的同源性序列，有66条序列未能够比对到相似序列。将其中未找到相似序列的66条进行了生物信息学分析，结果显示 20条序列含有信号肽区域；只有1条属于非经典分泌蛋白； 11条序列属于分泌通路信号肽（secretory pathway signal peptide,SP）,27条序列属于线粒体靶位肽（mitochondrial targeting peptide,mTP）；10条序列含有跨膜螺旋结构及信号肽区域。ProtFun结果显示多数序列参与蛋白合成，能量代谢，蛋白翻译等。Gene Ontology category 结果显示多数序列为生长因子，受体，离子通道，转录调节蛋白，结构蛋白，及免疫反应蛋白等。将两种蚊虫差异表达基因用CLUSTALX1.83比对，未发现有相同序列，中华按蚊感染了疟原虫后上调表达的热休克蛋白40（Hsp40）在斯氏按蚊模型中未发生上调，从另一侧面证明了该基因在蚊虫感染疟原虫免疫中有重要作用。