土壤重金属对微生物及抗生素抗性基因分布的影响及其机制研究

The spread of antibiotic resistance around the world is one of the most challenging problems in public health care. Environmental microbes and an unexpected density of antibiotic resistant genes (ARGs) in the environment may be the important causes of the dissemination of antibiotic resistance around the world. Associations between the levels of heavy metals and antibiotic resistance have been noticed for a long time. The constant exposure to heavy metals can increase the frequency of environmental bacteria with antibiotic resistance. However, influences of heavy metals on prevalence of soil environmental microbiota and ARGs, as well as the genetic mechanisms are presently poorly understood. Using environmental epidemiologic method, multiple displacement amplification for the whole genome, and 16S rDNA- denaturing gradient gel electrophoresis, heavy metal concentration, constitution of soil environmental microbiota and abundance of ARGs, MGEs in soil samples are comparing analyzed between area contaminated with heavy metals and control area. The aim is to elucidate how heavy metals might influence soil environmental microbiota and ARGs retaining and transmission, and to define genetic mechanisms that promote ARGs propagation, which is crucial for understanding how ARGs make their way into pathogens and developing management strategies to reduce the global risk of antibiotic resistance.

抗生素抗性的全球蔓延是目前公共卫生的重点问题之一。环境中大量的微生物及抗生素抗性基因（ARGs）是临床致病菌耐药性全球蔓延的重要原因。环境重金属污染水平与抗生素抗性的关联为人们熟知，重金属暴露可导致环境中具有抗生素抗性的微生物分布增加。但重金属对土壤微生物种群、ARGs分布的影响与机制尚不明了。运用环境流行病学方法、全基因组扩增、16S rDNA序列分析及荧光定量PCR等方法，对重金属污染区和对照区土壤样本的重金属水平、土壤微生物种群构成和ARGs、可移动基因单元（MGE）含量进行对比分析，探索土壤环境中重金属对微生物种群、ARGs分布影响的规律及其可能的水平转移机制，对于更好地理解ARGs怎样进入临床致病菌具有重要意义，为更有效地提出抗生素抗性控制措施提供科学依据。

为控制临床致病菌耐药性全球蔓延，研究促进抗生素抗性基因传播的环境因素具有重要意义。环境重金属污染与环境微生物抗生素抗性有关，但土壤重金属对土壤微生物及ARGs分布的影响及机制不明。本课题对重金属污染区和对照区进行重金属测定比较，针对主要的抗生素抗性基因ARGs和可移动基因单元MGE进行特异性扩增及定量分析，进行16s rDNA垂直变性梯度凝聚电泳和illumina测序等分析土壤微生物种群分布。结果发现，污染区共检出10种抗生素抗性基因，分别是sulⅡ（78.6%）、tetC（78.6%）、bla-TEM（64.3%）、sulⅠ（53.6%）、tetA（39.3%）、CTX-M-1（39.3%）、strA（32.1%）、tet M（21.4%）、qnrB（21.4%）和tetW（10.7%）。检出3种可移动基因元件基因intI1、intI2、ISCR2，其阳性率分别为67.9%、10.7%和25.0%。各PCR扩增阳性产物经测序及blast序列比对，与GenBank已有序列识别度95%-100%，分别获得GenBank登录号为KT625465- KT625472。各基因在不同距离土样中的阳性率差异均无统计学意义，但不同土样总基因检测阳性率在第一季度差异有统计学意义（P<0.05）。污染区土样中Cd、Pb、As、Hg、Cu、Zn、Ni等含量存在不同程度超标，其中Cd和铅的最大超标倍数达72.7和6.5。距工厂不同距离农田土壤中Cd、Pb、As、Hg、Cu、Zn等6种重金属分布存在差异，差异有统计学意义（P<0.05），提示距离工厂越近农田土壤的重金属污染越严重。对照区农田土壤中未检测到ARGs和MGE，且无重金属含量超标。荧光定量PCR结果可见随着采样区与工厂距离的增大，某些ARGs和MGEs的含量有降低趋势。测序分析发现离工厂最近的采样区土样中放线菌门比例第一（19.2%），酸杆菌门比例第二（10.9%）；相反离工厂最远的采样区土样酸杆菌门比例第一（15.6%），放线菌门比例第二（14.7%）。RDA分析表明重金属和土壤粒径都对土样的微生态组成造成相应影响。以上结果为进一步深入探索重金属促进抗生素抗性从环境微生物向临床致病菌转移的分子机制，更有效地控制抗生素抗性蔓延提供了科学依据。