miR-183对小鼠视网膜视锥细胞发育和功能维持的作用及其分子机理研究

In the mouse genome, microRNAs are arranged in scattered or clustered patterns and are involved in the regulation of post-transcriptional gene expression. A recently well-studied microRNA cluster, miR-183C, has been clarified to be critical for sensory systems, including pain, hearing and vision. In the mouse retina, removal of this cluster results in photoreceptor defects in cone polarization, phototransduction and outer segment elongation. However, the individual roles of the three members of this cluster are largely unknown. To separately study the function of miR-183 in vivo, we want to eliminate the miR-183 seed sequence using the CRISPR/Cas9 gene editing system without interfering other regions. By using SD-OCT (Spectral domain optical coherencetomography), retinal immunostaining, Electronic microscope, Electroretinogram (ERG) and Visual evoked potential (VEP), we will identify the structural and functional changes in this knockout mice. In terms of the molecular mechanistic study, we will reveal the mechanism of miR-183 and Rnf217 in the cone photoreceptor ciliogenesis. Elucidating disease mechanism and understanding the individual roles of miR-183 in mice could benefit the therapy of retinal disease patients and the application of stem cell differentiation.

微小RNA主要通过转录后水平对生物体各个阶段基因表达进行精确调控。近两年，miR-183簇已被证明是感觉神经系统不可或缺的，包括视觉、痛觉、听觉等。申请人前期发现，miR-183簇的敲除会导致小鼠视网膜视锥细胞核排列异位、外节缩短、明适应反应ERG消失等严重表型（PNAS一作）。本项目拟深入探究该簇中功能尚未明确的单一分子miR-183对小鼠视网膜功能和结构的影响；通过基因打靶技术特异性敲除成熟体序列；利用SD-OCT、免疫染色、电镜、ERG、VEP等技术分析miR-183对视网膜发育、结构维持、功能维持等方面的影响。在分子机理方面，拟通过深入研究Rnf217和潜在纤毛基因的互作关系，进一步阐明miR-183介导的分子通路如何影响视锥细胞纤毛功能。通过本项目的开展，分析miR-183在疾病中扮演的角色，为miR-183簇在视网膜疾病治疗及视网膜体外分化等研究中的应用提供关键的理论基础。

微小RNA主要通过转录后水平对生物体各个阶段基因表达进行精确调控。近两年，miR-183簇已被证明是感觉神经系统不可或缺的，包括视觉、痛觉、听觉等。项目负责人前期发现，miR-183簇的敲除会导致小鼠视网膜视锥细胞核排列异位、外节缩短、明适应反应ERG消失等严重表型。本项目拟深入探究该簇中功能尚未明确的单一分子miR-183对小鼠视网膜功能和结构的影响。项目组成员完成了申请书中重点提及的miR-183新靶点RNF217的体内体外验证工作。我们发现Rnf217主要影响BBSome基因（负责纤毛转运功能）的表达，这可能是视网膜出现损伤的主要原因之一。结构和功能的研究结果显示，敲除miR-183对视网膜的结构影响微弱，但影响视网膜功能。我们延续性地进行了miR-96敲除小鼠的构建，并初步发现miR-96主要影响光感受器细胞发育，特别是视锥细胞，但不导致渐进性凋亡（截止6月龄小鼠）。因此，我们可以初步判断该簇中的三个分子都对视网膜发育和功能维持都有一定贡献，按照重要贡献度排序应该是miR-96，miR-183和miR-182。此外，我们还对视网膜疾病新致病基因Cep250（纤毛基因，是miR-183簇的潜在靶点）进行了研究。.通过本项目的开展，明确了miR-183簇各分子对视网膜结构和功能的具体影响，也有了契机得以综合分析了它们在疾病中各自扮演的角色，阐明miR-183和miR-96影响结构和功能变化主要是通过纤毛和细胞运动相关的分子通路改变实现。本项目的研究成果为miR-183簇在视网膜疾病的诊断和治疗及视网膜体外分化等研究中的应用提供了关键理论依据。因为miR-183簇不光对视网膜有影响，在感觉系统和生殖系统甚至肿瘤中都有广泛的研究，是机体很重要的miRNA。因此，我们的研究也在一定层度上对其他非眼科疾病的研究也有一定参考意义。