LncRNA CCAT1调控HMGB1在视网膜母细胞瘤化疗耐药的作用及机制研究

Carboplatin resistance is the main cause of failure in the chemotherapy of retinoblastoma (RB), and HMGB1 plays a key role in the process,but the mechanism is unknown.Our microarray results showed that long non-coding RNA-CCAT1 was the most significant increase in carboplatin resistant RB cells.Further experiment found that down regulation of CCAT1 could increase the sensitivity of carboplatin resistant RB cells to carboplatin and HMGB1 expression decline.The expression of CCAT1 in RB cells was positively correlated with the expression of HMGB1.It is found that HMGB1 is a potential target gene for miR-152 through bioinformatics analysis and experiments.In addition, we have proved that CCAT1 regulates the expression of miR-152.Accordingly, we speculate that CCAT1 up-regulated the expression of HMGB1 through miR-152, causing RB to be resistant to carboplatin.This study is carry out at multilayers, such as cells, tissues, animals and the aim of this study is to make clear CCAT1 enhanced RB carboplatin resistance through HMGB1.And in addition elucidate the specific molecular mechanism of CCAT1 regulating HMGB1.Finally, the relationship between the expression of CCAT1 and HMGB1 in the RB tissue and its clinical features was analyzed.This study provides a new theoretical basis for the search for reversal of RB carboplatin resistance.

卡铂耐药是视网膜母细胞瘤(RB)化疗失败的主要原因，HMGB1在这过程中发挥关键作用，但机制不详。我们芯片结果显示，长链非编码RNA-CCAT1在卡铂耐药RB细胞中增加最为显著。进一步实验发现：下调CCAT1可增加卡铂耐药RB细胞对卡铂的敏感性；降低CCAT1的表达，HMGB1表达下降，且CCAT1与HMGB1的表达呈正相关。生物信息学分析和实验发现HMGB1是miR-152潜在靶基因，过表达miR-152，HMGB1表达下降；另外，我们研究证实CCAT1调控miR-152的表达。据此，我们推测CCAT1通过吸附miR-152上调HMGB1的表达，导致RB对卡铂耐药。本研究拟在细胞、组织、动物实验等多层面明确CCAT1通过HMGB1增强RB卡铂耐药，并阐明其调控HMGB1的具体分子机制，最后分析RB组织中CCAT1及HMGB1的表达与临床特征的关联,为寻找逆转RB卡铂耐药提供新的理论依据。

本课题组成功构建了卡铂耐药RB细胞株，发现CCAT1 在耐药细胞株中增加最为显著。降低 CCAT1后，Western blot 结果发现：AXL、p-AXL、c-Met 、p-c-Met 的表达下降，EGFR和 p-EGFR 变化不明显；裸鼠成瘤实验发现降低 CCAT1，联合使用卡铂，降低 CCAT1可以明显抑制肿瘤大小。我们研究了 CCAT1 在 RB 细胞中的分布：在 Y79 细胞中，CCAT1 同时存在于细胞核和细胞质中； 细胞核的比例远低于细胞质中的比例。我们使用 Starbase v2 搜索含有 CCAT1互补碱基对的 miRNA。生物信息学显示 CCAT1 共享 miR-152 的 miRNA应答元件（MRE） 和 HMGB1 的 3'UTR。此外，在RB 细胞中检测到 CCAT1 和 miR-152 的可比拷贝数，这对于 ceRNA-miRNA相互作用非常重要。miR-152 模拟物转染显著抑制 PGL3-CCAT1/WT 的荧光素酶活性，PGL3-CCAT1/MUT 对 miR-152 模拟物无反应。 结果表明 CCAT1 含有功能miR-152 结合位点。.化疗是RB的一线治疗，RNF6是一种E3泛素连接酶在癌症进展中起着重要作用。在耐卡铂的RB细胞，显示RNF6的mRNA和蛋白质水平的表达显著增加，细胞对卡铂的敏感呈现RNF6siRNA剂量依赖性方式，并且过度表达RNF6可以使细胞获得对卡铂的耐药性，进一步研究显示JAK2/STAT3通路参与RNF6诱导RB细胞对卡铂耐药。.缺氧是一种重要的肿瘤特征，HIF-1是一种细胞对缺氧反应的主要调节因子。我们研究了MDM2及其受体的作用与RB中HIF-1α的关系。对RB样本的分析显示MDM2表达与HIF-1α表达呈正相关与HIF-1α的调节因子von Hippel-Lindau蛋白（pVHL）负相关。进一步的免疫沉淀分析显示MDM2可以直接与pVHL结合并促进其泛素化和降解，从而导致HIF-1α的增加。用特异性抑制剂抑制MDM2和和/或HIF-1α可诱导RB细胞死亡并降低原代RB细胞的干细胞特性。研究表明MDM2通过pVHL和HIF-1α的促进肿瘤增殖，调控MDM2或HIF-1α可作为治疗RB的靶点。.我们成功构建了视网膜母细胞瘤PDX模型，为药物筛选提供了平台；同时开展了一些新药筛选实验。