NLRC4炎性体的调控在清除慢性下呼吸道感染中的关键作用

Chronic Pseudomonas aeruginosa (PA) lower respiratory track infection and colonization in bronchiectasis patients are difficult to be eliminated, which results in a large number of consumption of medical resources and high mortality of these patients. Inflammasomes were approved to play important roles in several pathogens caused lung infection. But the roles of them in chronic lung infection remain not clear. Based on our previous studies, we are planning to figure out the relationship between the level of macrophage NLRC4 inflammasome activation and the sustained PA pulmonary colonization or infection in patients with bronchiectasis through clinical analysis. We will find that if the defects of macrophage NLRC4 inflammasome activation play a key role in PA immune evasion in these patients. For in vitro experiments, we will use PA, flagella of PA and PA formatted biofilm to stimulate macrophage respectively. The activation of NLRC4 inflammasome and the mechanism of it will be analyzed. Following in vitro experiments, we will do in vivo research. We will establish the animal model of chronic lung infection by PA infusion using wild type mice and NLRC4 knockout mice. The infected mice will be infused of flagella, inactive or activated NLRC4 inflammasome macrophages after infection. Items of mice treated with different processing methods will be observed and analyzed, such as the in vivo activation of inflammasomes in lung, PA bacteria loads, and its influence on survival rate of the animal. The research will make it clear that the key role of NLRC4 inflammasome activation in the clearance of chronic PA pulmonary infection and colonization in mice, and to clarify the critical role of regulation of macrophage NLRC4 inflammasome activation in the intervention of Pseudomonas aeruginosa pneumonia. The ultimate aim of this study is to explore new avenues for bacteria clearance of chronic PA lung colonization and infection.

支气管扩张症患者慢性铜绿假单胞菌（PA）下呼吸道感染与定植难以清除，造成大量的医疗资源消耗和患者的死亡。在前期基础上，申请人拟通过临床分析支气管扩张患者巨噬细胞NLRC4炎性体活化程度与PA持续肺部定植感染的相关性，明确巨噬细胞NLRC4炎性体活化不足在PA肺部免疫逃逸中的作用。随后通过体外实验分别探讨PA菌体、鞭毛以及形成生物被膜的PA对巨噬细胞NLRC4炎性体的活化机制与作用，确定生物被膜包被鞭毛对PA激活NLRC4炎性体的影响。采用野生型或NLRC4基因敲除小鼠建立慢性PA下呼吸道感染模型，通过气道回输不同状态巨噬细胞，探讨不同处理方式对体内NLRC4炎性体的活化及PA肺部感染的作用及其对动物生存率的影响。研究将明确NLRC4炎性体激活在清除慢性PA下呼吸道中的地位，并探讨调控巨噬细胞NLRC4炎性体活化在干预铜绿假单胞菌肺炎中的关键作用，为慢性PA下呼吸道感染的清除探索新途径。

项目背景：近年来多项临床研究结果显示大环内酯类维持治疗在多种慢性肺部疾病取得了良好的疗效，特别是合并有铜绿假单胞菌感染的患者。但是，其抗炎和免疫调节作用的机制还不十分清楚。为此，本研究拟探讨大环内酯类是否通过调控炎症小体的活性来发挥免疫调节作用。.研究内容：在临床研究，收集NCFB患者使用阿奇霉素前和用药3-5天后的外周血，分离血浆。使用ELISA方法检测用药前后血浆IL-18的浓度。在动物实验，建立铜绿假单胞菌所致小鼠慢性感染模型，7天后对各组小鼠的肺组织损伤进行评估，对菌负荷量（CFU）进行检测，计算BAL中总细胞数和分细胞数，检测炎症小体相关蛋白含量及肺组织病理学研究。在细胞实验，使用PAO1菌或者鞭毛蛋白作为巨噬细胞炎症小体的激活剂，蛋白质免疫印迹方法检测不同浓度和不同时间点阿奇霉素或者红霉素对于炎症小体活性的影响。使用荧光共聚集技术检测在鞭毛蛋白在活化NLRC4炎症小体时，阿奇霉素对于ROS的影响。.重要结果：临床研究发现，合并铜绿假单胞菌感染的NCFB病人血浆IL-18水平显著高于健康对照者，使用阿奇霉素后，其浓度明显降低。体内研究发现，在铜绿假单胞菌所致小鼠慢性肺部感染模型中，阿奇霉素通过调控炎症小体的活性来缓解肺组织损伤。体外研究发现，在小鼠腹腔源性巨噬细胞，阿奇霉素能够抑制铜绿假单胞菌诱导的炎症小体的活化。进一步研究发现，阿奇霉素对铜绿假单胞菌鞭毛蛋白诱导的NLRC4炎症小体或者ATP诱导的NLRP3的炎症小体活化均有抑制作用。红霉素也有类似作用。从机制上讲，阿奇霉素通过抑制ROS的产生来调节炎症小体的活化。.科学意义：合并铜绿假单胞菌感染的支气管扩张症患者可能存在炎症小体的过度激活，炎症小体可能为支气管扩张症的治疗提供新的思路和靶点。探讨大环内酯类调节NLRC4炎症小体活性对铜绿假单胞菌慢性感染的作用机制，将为大环内酯类的免疫调节作用提供新的机制，为新药的开发提供新的思路，为慢性铜绿假单胞菌下呼吸道感染清除开拓更好的途径。