红花黄色素生物合成相关R2R3-MYB转录因子基因的克隆、表达分析及其调控机制研究

Safflor yellow is one of the main active ingredients extracted from safflower，which is a traditional Chinese medicine. Studies show that safflor yellow is in great demand on market, and applied widely in coronary heart disease, diabetes-related complications and other diseases, with many pharmacological effects, such as dilation of blood vessels,inhibition of thrombosis and antioxidation. At present, although safflower acreage continues to extend in China, there is still not able to resolve the resources demands of safflor yellow. Therefore,increasing the yield and breeding new variety with much higher production of safflor yellow is imminent. In this study, we will separate the regulatory gene (transcriptional factor R2R3-MYB) related to the regulation of safflor yellow biosynthesis;on the basis of safflower transcriptome sequencing, clone the full-length cDNA of CtMYB1 using gene cloning techniques, and research its expression characteristics, locations and transcription activities. Then we will further definite the role of CtMYB1 genes in regulation of safflor yellow biosynthesis by overexpression and knockdown of CtMYB1 genes, and lay a foundation for cultivating new safflower lines with high yield of safflor yellow and expanding the resources of safflor yellow by genetic engineering.

红花黄色素（safflor yellow）是从传统中药红花中提取的主要有效成分之一。研究表明，红花黄色素具有扩张血管、抑制血栓形成、抗氧化等多种药理作用，被广泛地应用于冠心病、糖尿病并发症等疾病上，市场需求量较大。目前，虽然我国红花的种植面积在不断扩大，但仍未能解决红花黄色素资源匮乏问题。因此，提高红花自身黄色素含量，培育高产黄色素的红花新品系已迫在眉睫。本项目拟在红花花瓣转录物组测序基础上,分离红花黄色素生物合成相关R2R3-MYB转录因子CtMYB1基因，利用基因克隆技术获得该基因的全长cDNA片段，确证其表达特性、定位及转录激活特性；在此基础上，通过超表达和RNAi技术研究CtMYB1基因调控红花黄色素合成途径中结构基因的表达及黄色素的含量变化，进一步明确CtMYB1基因在红花黄色素合成中的调控机制，为通过基因工程手段培育高产黄色素红花新品系和开发红花黄色素的资源奠定基础。

红花黄色素是红花的主要有效成分之一，属于植物次生代谢产物黄酮类化合物，具有扩张血管、改善心肌供血、抗氧化等多种药理作用。MYB蛋白作为调控因子，参与黄酮类化合物生物合成并发挥重要的作用。尽管前人已从红花中分离得到多个类黄酮合成代谢途径中的结构基因，但有关类黄酮代谢的转录因子目前未见报道，本课题首次从红花花瓣中分离1个R2R3-MYB基因，开展了红花MYB转录因子的基因表达特性、基因组结构、细胞定位以及功能分析等研究。具体包括：（1）利用实时定量RT-PCR方法分别对其表达模式进行分析，结果显示CtMYB1在根、茎、叶等营养器官中低表达，而在花瓣中高表达，且在衰花期达到最高。（2）HPLC法测定红花在不同开花期的羟基红花黄色素A的含量，结果表明在开花第7天，羟基红花黄色素A的含量最高，这一积累规律与CtMYB1基因在这些时期的表达情况基本一致，进一步表明CtMYB1基因对红花黄色素的合成可能具有调控作用。（3）成功构建了p1302-CtMYB1-GFP载体，通过其在洋葱表皮细胞的瞬时表达，确定了CtMYB1定位于细胞核中；同时借助酵母表达系统，确定了CtMYB1不具有转录激活活性。（4）构建了CtMYB1超表达载体并转化至拟南芥，发现超表达CtMYB1的转基因植株表型无变化。利用RT-PCR技术分析转基因植株中查尔酮代谢途径中重要基因CHS、CHI等表达水平的变化，结果显示，与野生型相比，转基因植株中CHS的表达水平显著降低，而CHI表达水平升高，表明CtMYB1过量表达引起了拟南芥中查尔酮类物质代谢的改变。（5）构建了CtMYB1 RNAi表达载体，获得转基因红花T1代植株；（6）通过原核表达、纯化获得大量CtMYB1蛋白用于制备抗体以及ChIP和EMSA验证靶途径。（7）从红花花瓣中分离到另外1个R2R3-MYB基因CtMYB12以及1个bZIP基因bZIP1，并分析了其表达模式及构建了植物及原核表达载体。本项目的完成将为深入理解黄酮类物质合成的调控机理，为通过基因工程手段培育高产红花黄色素红花新品系和开发红花黄色素资源奠定基础。本项目培养硕士研究生2名，培养本科生2名。发表论文14篇，其中SCI论文2篇。