基于多时间尺度探究卤醇脱卤酶催化功能的结构动态性基础及作用机制

Halohydrin dehalogenase from Agrobacterium radiobacter AD1 (HheC) displays a great potential in the synthesis of chiral building blocks-epoxides and a series of β-substituted alcohols for pharmaceuticals. However, the kinetic mechanism of the enzyme, especially its related structural dynamics has not been investigated in detail, which largely limits its industrial application. Taking the advantage of the fact that HheC exhibits a novel instinct fluorescence property and its substrates (nucleophiles) owning a unique character of IR spectrum, HheC represents a suitable model for exploring the relationship between enzyme function and the related structural dynamics. Thus, in this project, techniques such as steady-state and transient fluorescence spectroscopy, stopped-flow technique, FTIR and femtosecond 2D IR will be used to explore the structural dynamics of a functional important conformational change occurring in the dehalogenation reaction of HheC and the nucleophile promiscuity mechanism of the enzyme. In addition, enzyme mutagenesis techniques, MD simulation and QM/MM will be used as supplement tools for further proving. In the end, a relationship between the structural dynamics profiles and the enzyme activity will be built through data analysis and mapping. The results will greatly facilitate not only the theoretical understanding of the enzyme kinetics, but also the enzyme application in the field of chiral drug synthesis.

卤醇脱卤酶是一种多功能生物催化剂，通过分子内亲核取代反应高效、高选择地催化邻卤醇合成环氧化物及其逆反应，用来合成光学纯的环氧化物及β-取代醇等一类高价值中间体，极具应用潜能。目前，对上述酶促反应机理及其结构基础并未进行深入研究，不利于该酶的高效改造研究。鉴于该酶具有独特的内源荧光特性和其底物具有特征红外吸收，本项目在前期研究基础上，拟采用稳态-瞬态荧光光谱、停流荧光、FTIR、同时辅以飞秒二维红外技术，从多时间尺度、多结构层面阐述卤醇脱卤结构动态性的酶学功能，重点阐述酶调控酶催化活性的构象变化的结构基础及底物多样性的调控机制；结合蛋白质改造技术和理论计算等手段对相关研究进行验证、丰富和加以完善，进而建立卤醇脱卤酶催化活性及其底物多样性的精细调控网络。相关研究不仅有利于丰富相关酶促反应的理论基础，还将极大地促进该酶高效改造及其应用研究。

卤醇脱卤酶是一种多功能生物催化剂，通过分子内亲核取代反应高效、高选择地催化邻卤醇合成环氧化物及其逆反应，用来合成光学纯的环氧化物及β-取代醇等一类高价值中间体，极具应用潜能。对该酶促反应机理及其结构基础的深入研究，将有助于该酶在生物催化领域的应用。鉴于该酶具有独特的内源荧光特性和其底物具有特征红外吸收，本项目在前期研究基础上，采用稳态-瞬态荧光光谱、停流荧光、FTIR等多种实验手段，从不同角度和多结构层面阐述卤醇脱卤结构动态性的酶学功能。具体结果如下：建立及优化两种新的高通量卤醇脱卤酶活性检测方法；采用非天然氨基酸标记的手段对脱卤酶进行红外光谱和外源荧光探针标记，为后续酶动力学研究奠定物质基础；傅里叶红外光谱研究证明蛋白质在溶液中可能存在多种构象；结合内外源荧光探针证明了卤醇脱卤酶在催化过程中活性位点区域存在构象变化，均集中在活性位点4个Loop区域；采用半理性进化方法从构象变化和通道动力学角度探究四个Loop环间的相互作用，再结合计算机辅助设计手段从蛋白质柔性变化的角度对卤离子释放过程及其所伴随的构象变化的结构基础进行具体阐述。快速停留荧光实验结果进一步证明突变体酶活性的提高是由于卤离子释放速率及其伴随的构象的变化加快的缘故。因此，确切地说该构象变化是调控整个酶促反应活性的关键步，相关研究为进一步阐明卤离子释放通道及其相关机制奠定了基础。此外，4个Loop上的多个氨基酸也被证明不仅对催化活性很重要，同时也对酶对映体选择性和热稳定性有着显著调控作用。该项目的实施有利于进一步阐述酶调控酶催化活性的构象变化的结构基础及底物多样性的调控机制。