蜡状芽孢杆菌群呕吐毒素基因簇的水平转移机理研究

蜡状芽孢杆菌是一种条件性致病菌和常见的食品腐败菌，其呕吐型毒株产生的呕吐毒素（Cereulide）严重时可以导致人畜迅速死亡。我们前期对蜡状芽孢杆菌呕吐毒株进行了遗传多样性、生理生态多样性分析及毒力检测，初步发现呕吐毒素基因簇很可能是通过基因水平转移的方式获得，而国内外尚无这方面的报道。本研究以六株呕吐毒株代表三种主要类型作为研究对象，通过分析：1）呕吐毒素基因簇在质粒或染色体上的定位；2）病原质粒（编码呕吐毒素基因簇）的水平转移能力；3）呕吐毒素基因簇测翼序列测定及其与移动遗传因子MGE之间的关系；4）新MGE的转座和/或接合转移功能，从而揭示呕吐毒素基因簇的水平进化机理。该项研究将对控制呕吐型蜡状芽孢杆菌的潜在危害性提供科学依据和技术支撑，而且新移动遗传因子MGE的功能研究对构建工程菌具有重要的理论和指导意义。

蜡状芽胞杆菌是一种机会致病菌，能够引起两种食物中毒：呕吐和腹泻。其中呕吐型食物中毒是由呕吐型菌株产生的呕吐毒素引起，严重可致死。呕吐毒素，在化学结构上是由非核糖体多肽合成酶合成的十二环肽，在基因水平上由呕吐毒素合成酶基因簇（ces基因簇）编码合成。之前的研究发现ces基因簇位于一个270kD的pXO1相似性大质粒上，由7个基因cesHPTABCD组成，含有ces基因簇的呕吐型蜡状芽胞杆菌属于一个关系密切的分支。但近来研究发现呕吐菌株存在遗传和生态多样性，在进化上并不是原来所认为的那么保守。本研究我们通过比较5株呕吐型韦氏芽胞杆菌和2株呕吐型蜡状芽胞杆菌的菌株基因组和ces基因簇序列，发现这7株菌系统进化上分为三个枝，ces 基因簇侧翼具有不同类型的可移动元件。通过杂交分析，发现ces基因定位在染色体或大质粒上。分析了韦氏芽胞杆菌MC118/MC67 ces基因簇侧翼中的组成型转座子Tnces。发现Tnces由两个反向重复的ISces组成，分类上属于IS6家族。用KmR抗性基因标签代替ces基因簇构建了重组质粒Tnces::Km。Tnces::Km在大肠杆菌中的转座效率为1.04×10-3，转座无位点特异性，转座后在插入位点处形成8-bp正向重复。此外，在对呕吐毒素基因簇及侧翼序列比较分析过程中，发现cesH基因既存在于所有的呕吐菌株中，又存在于一些非呕吐菌株中且其序列高度保守，猜测其可能非呕吐毒素合成必需基因。因此通过cesH 基因敲除，构建突变菌株AH187∆cesH，并检测其呕吐毒素产量，发现AH187∆cesH 相较于野生菌株呕吐毒素产量提高了14倍左右，细胞毒力水平上升了40%左右，说明cesH基因对呕吐毒素的产量可能起负调控作用。. 总之，本研究在ces基因簇的进化上分析了呕吐菌株遗传背景多样性，ces基因簇的序列多样性、定位多样性和侧翼可移动元件，检测了转座子Tnces::Km在大肠杆菌中的转座活性和转座方式。在ces基因簇的表达调控上初步分析了cesH基因对呕吐毒素表达的负调控作用。该项研究将对控制呕吐型蜡状芽胞杆菌的潜在危害性提供科学依据和技术支撑，而且新的可移动元件的发掘对构建工程菌具有重要的指导意义。