基于SNP标记的中国松材线虫疫源追溯研究

Pine wilt disease （PWD） is a destructive disease upon pine trees. Due to its rapid spreading rate, the disease has drawn more and more attention all over the world. This project will collect Bursaphelenchus xylophilus strains from different provinces which are severely infected by the disease and employed high-throughput sequencing technique to conduct genome re-sequencing. The data generated by genome re-sequencing could cover the B. xylophilus at 40x which ensure the accurate identification of putative SNPs. Subsequent bioinformatics analyses are performed to reveal the SNP counts, distributions and genotypes among different B. xylophilus strains. Furthermore, we carried out the sub-population classification analyses based on previously identified SNPs to shed light on the genetic variations among different Bursaphelenchus xylophilus strains. Moreover, the geographic associated SNP markers are identified based on SNP genotypes among all strains. We also use Pyro-sequencing technique to validate previously identified SNPs, and those validated SNPs could be considered as potential biomarkers to establish rapid, accurate geographic origin detection system. The project will provide concrete theoretical and technical support to the prevention of PWD.

松树萎焉病是松树上的一种毁灭性病害，该病发展迅速，防治困难，引起了国内外的高度重视。本研究在收集中国境内发病严重地区松材线虫样本的基础上，利用高通量测序技术对松材线虫全基因组进行重测序分析。所有样本测序数据量均覆盖松材线虫基因组40倍以上，确保对松材线虫SNP位点的挖掘深度。使用生物信息学软件统计分析基因组测序结果，获取松材线虫SNP位点数量、分布、基因型等信息，明确不同松材线虫种群之间存在的遗传差异。根据不同种群间的SNP位点信息绘制种群遗传分化图谱，进行群体聚类分析，寻找各地区松材线虫之间的差异性。根据各松材线虫种群间的SNP位点基因型差异，筛选出于地理来源紧密相关的SNP位点并结合焦磷酸测序技术进行定性、定量分析。最终初步建立快速、准确的松材线虫疫源追溯系统，为松材线虫的防控工作提供理论与技术支持。

松材线虫（PWN，Bursaphelenchus xylophilus）是一种重要的检疫性有害生物，原产地在北美洲，对北美洲的乡土松种并未造成明显的损失(Mamiya 1983)。从上世纪初起松材线虫先后传入日本、中国和韩国等东亚地区，给该地区的松林带来了巨大的经济损失和生态破坏(Mamiya 2004；Soliman等2012)。1999年松材线虫又传入葡萄牙并随后在该国扩散蔓延，此后又传入了西班牙（Mota 1999;Inacio等 2015）。2020年初中国国家林业和草原局公告中明确，在2019年全国有18个省666个区县发生松材线虫病，面积达到1671万亩，当年病死松树达到数千万株。自1982年松材线虫病首次传入中国至今不过38年，病害已经在如此大范围大面积的流行，很明显人为长距离传播带病的疫木及其制品应该是病害传播的最主要的方式。在松材线虫病的防控措施中，最有效地手段无疑是管控好疫木，并通过检疫防止病原传入一个新的区域。因此，明确和掌握松材线虫病在中国的人为传播路径是有针对性地做好检疫防病的重要前提。尽管有关该物种已开展了广泛的研究，但尚无完整的参考基因组，并且对其种群内变异了解甚少。本项目对松材线虫近交系使用Pacbio+Bionano+HIC技术获得了一个（AH1）77.1MB（支架N50：9.2 MB）的染色体级别基因组。AH1比比之前发布的基因组更连续，更完整，并且包含具有潜在重要功能的新基因和转录本。随后，我们对来自中国和美国的181个虫株进行了重测序，发现了约780万个SNP。分析表明，中国的松材线虫可以进一步划分为与温度带密切关联的亚种群，并且在各省之间发生迁移。且与种群高度关联的SNP主要位于温度依赖性基因上，这表明线虫一直在进化并适应不同的温度。项目还开发了一种基于机器学习的方法来建立疫源追溯体系，只要有适当的SNP数据这种方法可应用于任何其他物种。