小鼠体细胞重编程中的染色质重塑路线图及表观遗传调控机制

Nucleosome is the fundamental unit of eukaryotic chromatin and the vector of histone modifications as well, and regulates many biological processes. Our published work revealed an accurate nucleosome remodeling during mouse somatic reprogramming, indicating it plays critical roles in reprogramming. However, little is known about the dynamic changes and epigenetic regulatory mechanisms of nucleosome remodeling in the process of reprogramming. To address this issue, here we plan to collect intermediate cells spanning the three representative stages of reprogramming: initiation, maturation, and stabilization, plus mouse embryonic fibroblasts (MEF) and induced pluripotent stem cells (iPSC) by FACS technique. We then generate genome-wide high resolution maps of nucleosome position and occupancy, histone modification deposition, and insulation protein CTCF genomic binding sites using high-throughput sequencing. Comparison of the adjacent stages will discover the dynamic changes of nucleosome positioning and active and repressive chromatin domains defined by the histone modifications. Taking advantage of our transcriptomic data, H3K4me1 and Oct4 ChIP-seq data, we further investigate how nucleosome remodeling regulates the accessibility of DNA cis regulatory elements and expression of corresponding target genes, construct the epigenetic regulatory networks of chromatin remodeling during reprogramming, uncover the roles of chromatin remodeling in the differentiation, acquisition and maintenance of pluripotency during reprogramming.

核小体是染色质基本结构单元，也是组蛋白修饰的载体，参与许多重要生理过程调控。我们已发表的工作发现重编程中发生精确的核小体重塑，表明它在重编程中起重要作用。但核小体重塑在重编程中的动态变化及表观遗传调控机制并不清楚。因此，本项目收集重编程中启动(initiation)、成熟(maturation)、稳定(stabilization)三个代表性阶段细胞，加上重编程前的小鼠成纤维细胞(MEF)与重编程结束得到的iPSC。绘制这五类细胞的全基因组核小体定位、组蛋白修饰分布、与CTCF全基因组DNA结合位点图谱。比较相邻阶段图谱，分析重编程中的核小体定位与活跃型和抑制型染色质结构域的动态变化。结合我们已有的重编程不同阶段的转录组、H3K4me1和Oct4 ChIP-seq数据，探究染色质重塑对DNA顺式调控元件可及性与基因表达调控模式，揭示重编程中染色质重塑的表观遗传调控机制，构建表观遗传调控网络。

体细胞重编程是一个复杂的生物过程。这一过程发生精确的染色质重塑，进行精确地调控基因转录表达，以获得并维持全能性。然而在重编程不同阶段，染色质结构发生怎样的变化，与核心全能性转录因子Oct4的互动模式，如何调控基因转录表达的分子机制并不清楚。本课题选定小鼠体细胞重编程的五个阶段：重编程前的MEF，重编程中的起始（initiation）、成熟（maturation）、稳定（stabilization）、与iPSC，利用高通量测序技术，测定这五个阶段的染色质结构（核小体与组蛋白修饰图谱）、核心全能性转录因子Oct4与绝缘子CTCF的DNA结合图谱、和基因表达谱。通过生物信息学技术整合分析这些数据来研究重编程过程中染色质重塑路线图，与Oct4的互动模式，及表观遗传调控机制。结果发现，Oct4以层级方式结合到靶点：1) 对于大部分靶点重编程第一天Oct4就结合上去，分别保持结合状态到起始阶段结束、成熟阶段结束、与iPSC。2) 只有一小部分靶点直到成熟阶段Oct4才结合上去，然后保持结合状态到iPSC。这部分基因主要都与全能性相关。染色质的开放与组蛋白修饰重塑为Oct4的层级式结合提前做好准备。如成熟阶段Oct4才开始结合的靶点，也是这个阶段H3K4me3与H3K27ac开始增加直到到iPSC。40.7% MEF激活的增强子在重编程第一天就失活，而且在重编程过程中增强子一旦失活就一直保持失活状态。相反，58.4% iPSC激活的增强子是从稳定阶段向iPSC转变时获得的，而且也是在重编程过程中增强子一旦激活就一直保持激活状态。类似地，增强子上H3K27ac的获得而被激活，从而招募Oct4结合到这些激活的增强子上，尤其在超级增强子上更显著。此外，增强子与启动子上组蛋白修饰的变化招募Oct4结合，二者协同调控全能性基因网络，让细胞最终获得并维持全能性。本课题结果揭示小鼠体细胞重编程中染色质重塑与Oct4结合的分子路线图及二者的互动对全能性获得与维持的分子调控机制，为进一步提高体细胞重编程效率与iPSC的安全性奠定理论基础。另外，本课题产生的大量测序数据也是多能性干细胞研究中的宝贵资源。