棉花干旱应答基因GhWRKY40的功能分析及调控机制研究

Drought is a major limiting factor to affect stable production of cotton in arid areas of Xinjiang. It is an excellent approach for cotton genetic engineering to isolate key genes correlating with drought tolerance and study of regulatory mechanisms.WRKY transcription factors play an important role in plant stress signal transduction, but fewer research involved in abiotic stress of cotton.On the base of previous research on cotton microarray data analysis of stress-resistant gene expression profiles,we identificated and cloned a multiple-stress induced WRKY gene, GhWRKY40,especially response to drought stress.We intend to obtain upstream promoter sequence of GhWRKY40 gene by genome walking technology,and to study its transcriptional regulation mechanism by transient expression of the sequence segments,to use overexpression and knockout technology in cotton to reveal the biological function of GhWRKY40,to study the regulatory genes of upstream and downstream by combination of microarray analysis of transgenic cotton and semi-quantitative PCR,to analyze the transcriptional regulatory network and reveal the molecular mechanism of cotton drought resistance, in order to provide technical support for cotton molecular breeding of drought resistance.

干旱是影响新疆干旱区棉花生产稳定的主要限制因素。抗旱关键基因的发掘及其调控机制研究是棉花抗旱性基因工程改良的基础。WRKY转录因子在植物逆境信号转导中具有重要作用，但在棉花中关于WRKY基因参与棉花非生物胁迫的研究较少。项目组基于前期棉花抗逆性基因表达谱的基因芯片数据分析，鉴定并克隆了一个多逆境尤其显著响应干旱胁迫的WRKY基因- - GhWRKY40。本项目拟采用染色体步移法，获取该基因上游启动子序列，通过序列节段瞬时表达试验，研究其自身转录调控机制；同时采用过量表达转基因棉花和基因敲除技术，揭示GhWRKY40的生物学功能；转基因棉花基因芯片分析和半定量PCR相结合，研究其上下游调控基因，解析其转录调控网络，揭示棉花抗旱性分子机理，为棉花抗旱性分子设计育种提供技术支撑。

干旱是影响新疆干旱区棉花生产持续发展的主要限制因素，抗旱关键基因的发掘及其调控机制研究是棉花抗旱性基因工程改良的基础，WRKY转录因子由于在植物逆境信号转导中具有重要作用而备受关注。由于植物对干旱等耐逆性是由多基因共同控制的复杂性状，与导入个别功能基因来提高某种抗性的方法相比，增强一个关键的转录因子来调节下游多个抗逆功能基因综合发挥作用，将会使植物的耐逆性得到综合的显著改良。.本研究基于陆地棉抗逆性基因表达谱芯片数据，围绕GhWRKY40转录因子的生物学功能研究及转录调控进行了研究。1.通过RT-PCR和Real-time PCR分析得出GhWRKY40的转录同时受外源ABA和干旱胁迫的诱导，表明GhWRKY40是一个提高植物抗旱性的潜在功能基因。2.构建陆地棉GhWRKY40基因的超表达载体以及RNAi载体转化棉花Coker 312及YZ1，并获得了转化植株。干早胁迫处理实验表明，过量表达GhWRKY40的转基因棉花表现出明显优于野生型对照的抗早功能，在水分胁迫下有较强的适应能力。这些结果表明，GhWRKY40基因的过量表达能够提高棉花抗早能力，此基因可作为棉花抗早育种的优良候选基因资源。3.根据已获得的GhWRKY40基因启动子序列，构建了启动子、启动子依次缺失片段与GUS基因融合载体转化拟南芥，GUS染色结果显示，GhWRKY40启动子-294—--613区域存在与干旱应答有关的重要调控元件，证明GhWRKY40参与植物干旱胁迫响应并能增强棉花对干旱的耐受性。4.研究发现GhLsp启动子可能参与植物干旱胁迫应答并发挥重要作用，项目对陆地棉叶片特异性表达启动子GhLsp进行了表达分析，结果显示Ghlsp启动子能特异性地启动GUS基因在叶片中表达。5.通过本项目的实施，协助培养硕士研究生2名，发表论文2篇，投稿2篇。.项目通过对棉花逆境胁迫基因GhWRKY40及其调控机制的研究，对棉花抵御干旱的分子机制有更深入的了解，为基因工程综合改良作物的抗旱性提供了一条有效的技术途径，为进一步研究作物的抗逆机制及抗逆作物新品种的培育奠定基础，具有重要的理论和现实意义。