肝细胞生长因子对腰椎间盘退行性变的转归作用及相关机制研究

Intervertebral disc degeneration (IDD) is represented as losing of vessels in the endplates, apoptosis of disc cells, and worsening of extracellular matrix (ECM). It is necessary to retard IDD by improving those changes. Our previous study demonstrated that hepatocyte growth factor (HGF) retarded IDD by promoting the synthesis of type II collagen and the expression of BMP-2. However, whether HGF has effects on the synthesis of ECM participated by BMP-2 remains unknown. Furthermore, it is still unclear whether HGF has effects on suppression of disc cells apoptosis and promotion of endplates angiogenesis. In this item, we propose to research the effects of HGF on suppression of disc cells apoptosis and promotion of endplates angiogenesis by animal experiments, and explore the mechanism of the effects of HGF on synthesis of ECM participated by BMP-2. This item will provide the evidence of the therapeutic effects of HGF on retarding IDD which could be an option for clinical application.

腰椎间盘退行性变的主要表现为椎体软骨终板微循环减少，椎间盘细胞凋亡和细胞外基质改变。为达到椎间盘退行性改变的转归效应，从以上三个方面进行干预缺一不可。我们前期已发表的论著证实肝细胞生长因子（HGF）能够促进大鼠尾椎间盘内II型胶原的合成和骨形态发生蛋白2（BMP-2）介导的修复作用转归退变，但HGF是否参与激活BMP-2介导的细胞外基质合成途径有待进一步证实，另外HGF抑制椎间盘细胞凋亡和促进血管新生的作用有待验证。本项目拟通过动物实验进一步探究HGF是否具有抑制椎间盘细胞凋亡和促进软骨终板血管新生的作用，并通过体外实验探究HGF对BMP-2介导细胞外基质合成的影响和机制。本项目为HGF延缓椎间盘退变的临床应用提供一定的分子生物学依据。

本课题历时3年，从circRNA引起椎间盘退变的机制方面层层递进，从引起椎间盘退变的circRNA的初步筛选，circRNA诱发椎间盘退变的具体机制，以及外泌体运载circRNA诱发椎间盘退变的具体机制三方面入手，揭示了椎间盘退变的重要分子机制，为今后的椎间盘退变的分子生物学预防和治疗奠定了基础。第一，对影响人椎间盘退变的可能circRNA进行筛选和初步确认。从Gene Expression Omnibus database下载circRNA表达数据，并根据人椎间盘circRNA的长度进行分类，我们利用共表达分析对76个差异表达circRNA和宿主基因进行了配对，最后通过逆转录定量聚合酶链反应验证了hsa_circ_0008305上调和hsa_circ_004194下调与椎间盘退变有关。综上，课题组对人腰椎间盘的circRNA做了功能富集分析，初步确定了椎间盘中特殊表达circRNA的宿主基因，为椎间盘退变的分子生物学诊疗提供了一定的参考。第二，对circRNA-104670在椎间盘退变中作用进行了研究。课题组分别对人退变椎间盘与正常椎间盘的髓核细胞进行了基因芯片分析，从在退变髓核细胞中显著上调的circRNA中筛选具有代表性的circRNA_104670进行针对性研究。通过荧光素酶报告和EGFP/RFP报告分析，发现circRNA_104670可与miR-17-3p直接结合，而miR-17-3p被抑制后可以使髓核细胞凋亡和MMP-2表达增加，引起ECM的降解，加速了椎间盘的退变。第三，外泌体运输circRNA_0000253调控椎间盘退变的相关机制的研究。本课题组进一步探究外泌体运输的circRNA调控椎间盘退变的机制。我们分离出不同程度退变椎间盘中的外泌体，加入髓核细胞，检测髓核细胞增殖和凋亡的指标。进行circRNA微阵列分析，选出前10个表达上调的circRNA。在正常和退化的髓核细胞外泌体中进行PCR检测circRNA的表达，并选择最大上调的circRNA_0000253。进行竞争内源RNA（ceRNA）分析，并在体内和体外验证circRNA的功能。发现外泌体包裹的circRNA_0000253能够竞争性吸附microRNA-141-5p，从而使SIRT1表达下调，引起椎间盘退变。