酸性条件下分枝杆菌PhoPR调控DNA旋转酶活性的分子机制研究

DNA gyrase, a type II topoisomerase, catalyzes the changes of DNA topology and participates in DNA replication, transcription and recombination. In phagolysosome, mycobacteria can sense the acidic condition and carry out a series of gene regulation. And the changes of DNA topology are always involved in the process of gene regulation. However, the molecular mechanism of regulation of DNA topology under acidic condition is unknown. Previous results indicate that PhoPR is involve in sensing and gene regulation under acidic condition. In addition, our results in pull-down experiments suggested that PhoP might directly bind on DNA gyrase. All these suggest that PhoP may bind on DNA gyrase and regulate the activities of it, and then result in the change of DNA topology. In this project, we proposed to determine the interaction and the binding region of PhoP and DNA gyrase through pull-down experiments and SPR firstly, and afterwards verify the regulation of DNA gyrase by PhoP using relaxation assay and supercoiling assay. Furthermore, we will confirm the regulation of DNA topology by PhoPR in different mycobacterial mutant strains under acidic condition. Taken together, a novel molecular regulatory mechanism of PhoP in regulation of DNA topology will be elucidated under acidic condition.

DNA拓扑酶在DNA复制和转录等过程中发挥着重要作用。酸性pH是结核分枝杆菌感染的重要的胞内信号，调节基因表达并建立慢性感染, 其中必然伴随着DNA旋转酶介导的DNA拓扑结构改变。但酸性条件下分枝杆菌通过调控DNA旋转酶介导的DNA拓扑结构的具体机制尚不清楚。我们前期研究发现PhoPR参与酸性条件下转录调控帮助分枝杆菌适应环境，同时PhoP与DNA旋转酶相互作用，因此我们推测酸性条件下PhoPR被激活，PhoP调控DNA旋转酶活性，影响DNA拓扑结构改变。本研究将通过体外垂钓以及表面等离子共振等技术确定PhoP与DNA旋转酶的相互作用及其方式，并通过质粒的松弛实验和超螺旋实验确定PhoP对DNA旋转酶的调控，最后通过酸性条件下不同菌株中质粒状态的不同确定分枝杆菌调控DNA拓扑结构的新机制。项目研究将增进结核分枝杆菌建立慢性感染的认识，为防控慢性传染性疾病提供坚实的理论基础。

DNA拓扑异构酶在DNA复制和转录等过程中发挥必需功能。酸性条件是对结核分枝杆菌进行调控并产生慢性感染的重要因素，在调控的过程中必然伴随着DNA拓扑结构的变化。但酸性条件下分枝杆菌调控DNA旋转酶的机制尚不明确。本研究首先通过蛋白垂钓实验发现PhoP可能直接与DNA旋转酶相互作用调控其功能，随后通过基因敲除实验明确phoPR操纵子在酸性条件下的重要性。为进一步确定相关调控，利用体外表达纯化的PhoP和DNA旋转酶蛋白进行了相关活性实验，结果发现PhoP可以抑制旋转酶的促螺旋活性和ATP酶活性。然后又分别纯化了PhoP的N端和C端截短蛋白，活性实验中发现该两个截短蛋白均不能抑制旋转酶的活性，表明抑制活性需要全长的PhoP。接下来在ATP酶活性检测中添加MfpA蛋白，在此条件下PhoP不能抑制被MfpA激活的活性预示PhoP的调控作用依赖于DNA。随后我们利用DNA片段进行相关实验发现PhoP可以抑制DNA片段激活的旋转酶的ATP酶活性。为检测PhoP是否抑制其他拓扑异构酶的活性，我们检测了对结核分枝杆菌拓扑异构酶I活性的影响，结果发现PhoP对其活性存在一定的抑制。以上结果表明PhoP可能通过同时调控旋转酶和拓扑异构酶I调控DNA的拓扑结构，并与PhoP对相关基因转录表达的调控产生协同效应，共同帮助分枝杆菌适应酸性压力条件。