缺氧微环境下微管相关蛋白4对表皮细胞迁移能力的影响及其机制研究

皮肤创伤后局部缺氧微环境调控表皮细胞迁移介导创面再上皮化,是影响创面愈合的重要因素,但其分子调节机制不明。课题组前期研究发现,缺氧后表皮细胞微管动力学及其调控分子微管相关蛋白4(MAP4)具有表达和分布变化的一致性，并且磷酸化的MAP4与动力蛋白亚单位Tctex-1具有相似变化趋势；鉴于前期还发现MAP4可上调Tctex-1 表达,结合文献,提出"缺氧微环境下MAP4通过Tctex-1 调控微管动力学影响表皮细胞迁移"的假设。并拟系统观察缺氧后表皮细胞微管动力学变化,MAP4的表达或磷酸化修饰情况,以及Tctex-1的表达和分布变化；采用免疫荧光和共沉淀等技术研究MAP4和Tctex-1 的相互作用关系,建立两者的高/低表达细胞模型，阐明MAP4对微管动力学的影响，并探讨MAP4是否通过Tctex-1发挥作用。对阐明缺氧后表皮细胞微管动力学调控的分子机制，深化创面愈合机制的认识具有重要意义

皮肤创伤后局部缺氧微环境调控表皮细胞迁移介导创面再上皮化,是影响创面愈合的重要因素,但其分子调节机制不明。本课题按照研究计划，系统观察了缺氧后Hacat细胞的迁移情况和微管动力学的动态变化，发现在1%氧浓度条件下培养24h，观察到Hacat表皮细胞迁移增加（transwell和划痕实验），采用激光共聚焦显微镜观察到随缺氧时间延长，细胞呈现多形性，骨架松散。WB证实MAP4在24h内随缺氧时间呈现“增加—降低—增加”的方式，Tctex-1在24h内随缺氧时间延长逐渐增加。采用免疫共沉淀证实MAP4和α-tubulin具有相互作用。在此基础上，构建了相应的MAP4高/低表达和Tctex-1高/低表达细胞模型。在上述缺氧条件下，观察到干扰MAP4和Tctex-1后，细胞骨架在缺氧后未见明显疏松，无边集化现象，细胞的迁移能力受到明显限制，缺氧后未见增强；过表达MAP4后，细胞的迁移能力轻度增加，过表达Tctex-1后，细胞的迁移能力得到增强；过表达MAP4或Tctex-1后，细胞骨架疏松，呈多形性。采用WB观察MAP4、p-MAP4和Tctex-1的表达变化，观察到p-MAP4与MAP4的表达类似，高/低表达的MAP4会相应地提高或降低Tctex-1的表达，结合各组细胞在缺氧后迁移能力的变化，说明在缺氧微环境下，MAP4的表达变化可引起Tctex-1的表达变化，从而影响表皮细胞的迁移。另外，还利用部分研究经费，补充研究了Gαi-1/3在表皮细胞迁移中的作用。发现在创面皮肤和瘢痕中，Gαi-1和Gαi-3表达增加。干扰Gαi-1和Gαi-3后，可抑制缺氧诱导的MAP4表达增加和细胞迁移，并且抑制Akt-mTOR通路激活。还补充研究了有关创面动物模型的研究，比较了普通热烧伤和激光烧伤后，大鼠皮肤的损伤和愈合规律。发现激光作用后，随作用时间延长，在水平方向和垂直方向上，损伤程度增加明显，各组之间愈合情况差异明显；而普通热烧伤的变化不明显。共发表SCI论著2篇，中文论著1篇，综述1篇，获得国家发明专利授权1项。