家蚕微孢子虫外泌蛋白质组主要成分及其功能研究

Microsporidian Nosema bombycis is very harmful for its vertical transmission via graine, and its quarantine is a severe sericultural problem to be resolved.Excretory proteins are important infectious/viral factors of intracelullar parasite.Our last project studied the Ricin B-lectin (RBL) of N. bombycis and found that the RBL can interact with polyubiquitin of silkworm Bombyx mori (host) and probably regulate the ubiquitin pathway of silkworm. Then what proteins do N. bombycis excrete to the host cell? Where will these proteins locate to and What are their functions and effects? Based on the previous study and the platform of gene functional study on N. bombycis and silkworm, this project intend to develop method of extracting exretory proteins, separate and identify main component of the N. bombycis excretome, and study their sequence features, functional classification and subcellular localizations and then identify their interacting proteins, so that screen important infectious/viral factors. Furthermore, we will study the functions and roles of these factors involved in infection, immune regulation, development and metabolism, including the Ricin B-lectin. This project will provid important data and reference for studying on the mechanism of microsporidia infection, and provid valuable targets for researches on microsporidia quarantine and prevention.

家蚕微孢子虫能经卵垂直传播对蚕业生产危害巨大，其检测防控是亟待解决的产业难题。外泌蛋白是细胞内寄生性病原的重要侵染/毒力因子。我们前一期国家自然科学基金青年基金项目研究发现，家蚕微孢子虫外泌性Ricin B-凝集素能够与家蚕（宿主）的多聚泛素相互作用，可能具有调控家蚕泛素通路的功能。然则家蚕微孢子虫主要向外分泌哪些蛋白？这些蛋白靶向家蚕细胞的什么位置？具有什么功能作用？本项目拟基于前期研究，利用家蚕微孢子虫和家蚕功能基因组研究平台，建立外泌蛋白分离纯化方法，筛选家蚕微孢子虫外泌蛋白质组主要成分，分析其序列特征、功能分类和靶向定位，并鉴定其互作靶蛋白，从中发掘重要侵染/毒力相关因子，进而深入研究包括Ricin B-凝集素在内的重要蛋白在孢子侵染家蚕及调控家蚕免疫、发育和代谢等通路过程中的作用，为深入解析家蚕微孢子虫的侵染机制提供数据支撑和理论参考，并为家蚕微孢子虫的检测防控研究提供候选靶标。

微孢子虫是一类专性细胞内寄生的单细胞真核微生物病原，能够感染几乎所有的动物，包括蚕、蜂、虾等重要经济动物和人，危害人类生产和健康。分泌蛋白是胞内病原的重要毒力因子，但微孢子虫分泌蛋白质的组成和功能尚不清楚。本项目基于生物素-链霉亲和素系统构建了有效分离鉴定微孢子虫分泌蛋白质组的方法体系，从感染家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）的家蚕胚胎细胞系（BmE）的各个细胞器中分离鉴定了该病原的90种分泌蛋白，其中细胞质定位的有30个，细胞核定位的有14个，线粒体定位的有42个，内质网定位的有4个。基于此，项目组筛选了5个细胞核定位和5个线粒体定位的分泌蛋白为候选靶标，开展蛋白表达、抗体制备、细胞转染和RNAi、蛋白互作分析等实验，验证靶标蛋白在宿主中的亚细胞定位，并分析其功能，从而探讨分泌蛋白在微孢子虫侵染增殖过程中的作用。研究发现，其中微孢子虫中保守的己糖激酶（HK）在N. bombycis感染前期被分泌至宿主的细胞核和细胞质中，后期则仅定位于宿主细胞核中，在宿主细胞中过表达NbHK发现病原的增殖和宿主细胞ATP的合成均被增强，RNAi下调NbHK的表达则显著抑制了病原的增殖，表明HK在宿主细胞中具有多重亚细胞定位特征，并具有增强宿主能量代谢以促进病原增殖的重要作用，同时也说明分泌蛋白在微孢子虫侵染增殖过程中发挥着非常重要的作用。本项目研究所鉴定的分泌蛋白均是解析微孢子虫侵染及其与宿主相互作用机理的关键靶标，具有非常重要的学术研究价值，并具有应用于检测防控研究的潜在应用价值。此外，本项目研究过程中还鉴定了家蚕BmE细胞的线粒体、细胞核、内质网和细胞质的蛋白质组，对家蚕的研究具有重要参考价值。项目组目前已发表研究论文7篇，申请专利3项，培养博士3名，硕士6名，尚有4名博士生和2名硕士生在读并继续开展本项目研究工作。