基于Angs/Tie2介导的整合素αvβ3信号通路研究芪术颗粒抗肝纤维化血管新生的分子机制

From initial theory, clinical usage, and experimental researches, “Poison and blood stasis of liver collaterals”—the fundamental etiology of hepatic fibrosis—was recognized. Based on therapeutic, an effective antihepatic fibrosis medication, Qizhu granule, has been developed. It ameliorates hepatic sinusoid capillarization through modulation of expression of Angs/Tie2 mRNA, which in turn delays hepatic fibrosis formation. Capillarization of hepatic sinus induced by neoangiogenesis coexists with hepatic fibrosis,and Angs/Tie2 induced integrinαvβ3 signaling pathway plays an imperative role in the processes of hepatic sinusoid vasculogenesis and capillarization. We suspected that the efficacy of Qizhu granule was probably due to interference of Angs/Tie2 induced integrinαvβ3 signaling path way. In this research, we will confirm the implication of Qizhu granule on Angs/Tie2 induced integrinαvβ3 signaling pathway internally and externally. We will discuss Molecular mechanism of Qizhu granule from a brand new perspective, and perfect the collateral disease theory of treating hepatic fibrosis, provide the experimental basis for Huayu Tongluo therapy in the treatment of liver fibrosis,plays an imperative role in developing and enhancing the theory of collateral disease.

在前期理论、临床与实验研究中我们认识到“毒瘀肝络”是肝纤维化的基本病机，在此基础上研制出了抗肝纤维化的有效药物-芪术颗粒，并证实该药可通过调控Angs/Tie2 mRNA的表达减轻肝窦毛细血管化，减少肝纤维化的形成。血管新生引起的肝窦毛细血管化与肝纤维化相伴而行，而Angs/Tie2介导的整合素αvβ3信号通路在肝窦血管新生中起着重要作用。因此我们设想，芪术颗粒可能是通过Angs/Tie2介导的整合素αvβ3信号通路影响血管新生而发挥抗肝纤维化作用。在本研究中，通过体内和体外实验研究芪术颗粒对Angs/Tie2介导的整合素αvβ3信号转导通路的影响，以进一步研究芪术颗粒抗肝纤维化血管新生的机制，从一个新的角度探讨其化瘀通络作用的分子机理，对完善从络病论治肝纤维化的认识、发展和深化中医络病理论有重要意义。

背景与目的：基于“毒损肝络”的理论，研制出了治疗肝纤维化的有效中药--芪术颗粒。本项目基于Angs/Tie2介导的整合素αvβ3信号通路研究芪术颗粒抗肝纤维化血管新生的分子机制，以进一步阐释该药抗肝纤维化的机理，为化瘀通络法治疗肝纤维化提供实验依据。.方法：四氯化碳复制大鼠肝纤维化模型，同时给予芪术颗粒灌胃预防，并设立正常对照组、模型对照组及复方鳖甲软肝片对照组，治疗4周，取肝组织免疫组化方法染色肝窦CD31、CD34、vWF 、Caveolin-1、Angs/Tie2、整合素αvβ3的表达，并作半定量分析。并以CD31、CD34为对象进行微血管密度分析，评价微血管增生的部位和程度。Western blot法检测肝组织CD31、CD34、vWF、Caveolin-1、Angs/Tie2、整合素αvβ3、FAK-Ras/MAPK、ILK／Akt的蛋白表达。建立四氯化碳处理大鼠肝窦内皮细胞模型，设立正常组、模型组、芪术颗粒高剂量组、芪术颗粒中剂量组、芪术颗粒低剂量组、复方鳖甲软肝片对照组，用Wistar大鼠制备芪术颗粒高、中、低剂量组及复方鳖甲软肝片组药物血清，在探索有效无毒区间剂量下，与相应组别的细胞模型共培养24小时，流式细胞仪检测肝窦内皮细胞。电镜观察肝窦内皮窗孔情况及数目。Western blot法检测CD31、CD34、vWF 、Caveolin-1、Angs/Tie2、整合素αvβ3及其下游相关蛋白FAK-Ras/MAPK、ILK／AkT的表达。.结果：芪术颗粒组肝窦CD31、CD34、vWF、Caveolin-1的表达下调，肝窦微血管密度减少，肝窦微血管新生减弱，减轻了肝窦毛细血管化。扫描电镜观察见芪术颗粒组肝窦内皮细胞的窗孔有所恢复。整体动物实验及细胞实验均提示，芪术颗粒可使Ang2/αVβ3信号通路及其下游的FAK-Ras/MAPK、ILK/AKT信号通路的蛋白表达下调。.结论：芪术颗粒对肝纤维化大鼠肝窦微血管增生有抑制作用，可减轻肝窦毛细血管化，从而抑制肝纤维化，其机制与抑制Angs/Tie2介导的整合素αvβ3-FAK-Ras/MAPK、ILK／AkT信号通路有关。.科学意义：本研究阐明了芪术颗粒化瘀通络作用的分子机理，对完善从络病论治肝纤维化的认识、发展和深化中医络病理论有重要意义。