非特异性脂转移蛋白调控番茄果实软化的分子机制

Fruit softening is the significant characteristics of tomato fruit ripening, the direct cause of the edibility, and also the key factor of the shelf life of tomato. Through transgenic research, we found a nonspecific lipid transfer protein (nonspecific lipid transfer protein, nsLTP) involved in the regulation of tomato fruit softening. RNAi expression of nsLTP gene can extremely increase the storability of tomato. In order to radical parse the mechanism of nsLTP in the regulation of tomato fruit soften, this research will inquire into the pulp cell structure, the curticle components, as well as the change of cell wall hydrolase activity in RNAi-nsLTP transgenic tomato fruits. Furthermore we plan to use the transcriptome sequencing to analysis the key functional period and position of nsLTP protein in regulation of tomato fruit softening. And by using yeast two.hybrid technology, we could screen nsLTP protein interactions and the new functional genes in regulation of tomato fruit softening. Combined, the steps outlined above can further study the mechanism of tomato fruit softening and genetic engineering method to improve tomato fruit storability.

果实软化是番茄果实成熟的显著特征，是导致番茄果实成熟和可食用的直接原因，也是影响番茄果实贮藏性的关键因子。非特异性脂转移蛋白(nonspecific lipid transfer protein, nsLTP) 是参与番茄果实软化的调控因子之一。前期研究中，申请人发现RNAi抑制nsLTP基因家族表达能显著提高番茄果实的耐贮藏性，并已观测到nsLTP-RNAi转基因番茄果实果肉细胞结构、果实表皮蜡质及角质组分、以及病原菌侵染抗性的变化。为全面解析nsLTP蛋白调控番茄果实软化的作用机制，本项目计划对nsLTP-RNAi转基因番茄采后不同时期果实进行转录组测序分析，剖析该蛋白在番茄果实成熟软化中的关键作用时期及调控途径；并利用酵母双杂交技术筛选果实成熟期nsLTP的互作蛋白，进一步发掘调控番茄果实软化新因子。本研究将为番茄果实软化分子机理的深入研究和基因工程改良番茄耐贮藏性奠定基础。

番茄(Solanum lycopersicum)是在世界范围内深受人们喜爱的果蔬，作为全世界最重要的园艺作物之一，在我国蔬菜产业中具有重要的地位。同时番茄也是研究果实熟成熟最为重要的模式植物之一。果实的质地是番茄重要的商品性状，其形成过程包含伴随多种复杂的生理过程并涉及许多生物活性物质，因此对番茄果实质地的调控一直是研究果实成熟领域的热点。番茄果实的软化是其进入成熟期后的一个显著特征，也是使番茄果实具备可食用性的直接原因和影响番茄贮藏性的关键因子。.本课题组在前期研究中发现番茄非特异性脂转移蛋白nsLTP 可能参与番茄果实质地形成，通过转基因技术对上述基因进行了系统的功能鉴定，所获得研究结果如下：. 1. 转nsLTP基因干涉株系的番茄果实，其采后PG酶的活性降低，果肉细胞排列紧密。通过扫描电镜观察，在破色期后第14天，其外层薄壁细胞形态完好，细胞壁降解程度低，表现出良好的抗衰老特性。双荧光蛋白实验显示，番茄nsLTP蛋白与PG2A之间存在互作，通过调节PG的酶活来行使其生物学功能。. 2. 在番茄果实中抑制nsLTP基因的表达，番茄表面蜡质层增厚，利用GC-MS对果实外蜡成分分析发现，有10种蜡质组成成分存在显著差异，且多为饱和烷烃类化合物，与野生型对照番茄果实相比，正己烷和三十一烷在转基因番茄果实中的含量显著增加，而另外8种烷烃类化合物，如十二烷、正戊烷、庚烷、十五烷、辛烷、正十八烷等仅在野生型对照（中蔬6号）中被检测到。 . 3. 转nsLTP-RNAi番茄果实蜡质合成途径中关键酶CYP86和MS2的表达模式发生改变，酵母双杂交结果显示，nsLTP与一个参与番茄果实蜡质运输的HD-Zip IV转录因子Cutin2存在蛋白互作，BiFC结果显示该互作呈阳性。. 4. 转nsLTP干涉株系的番茄果实相对含水量低，在采后贮藏期失水率低于野生型对照（中蔬6号）番茄果实。灰霉病接种实验显示，转基因番茄果实对灰霉病具有良好的抗性，接种后第3天灰霉菌菌斑明显小于对照，灰霉菌菌丝增殖受到抑制。