ANO1通过MEK/ERK/ELK1途径介导百草枯诱导巨噬细胞NLRP3炎性小体活化作用机制

The mechanisms of NLRP3 inflammasome-mediated inflammation in macrophage induced by paraquat is unclear. We found that the calcium-activated chloride channel ANO1 and NLRP3 inflammasome as well as MEK/ERK/ELK1 pathway were activated in paraquat-induced macrophages; the activation of MEK/ERK/ELK1 pathway and NLRP3 inflammasome was reduced by the ANO1 inhibitor. It was predicted that there were the ELK1 binding sites in the promoter region of NLRP3 using the biological software. Therefore, we hypothesize that ANO1 might regulate NLRP3 inflammasome activation in paraquat-induced macrophage via MEK / ERK / ELK1 pathway. In this study, we will use gene overexpression/silence technology to clarify the mechanism of ANO1 regulated NLRP3 inflammasome activation in paraquat-induced macrophages. Additionally, we will use the inhibitors of MEK / ERK / ELK1 pathway illustrate its key role in the regulation of NLRP3 inflammasome activation. Finally, we will use the dual-luciferase report gene system to determine the promotor of NLRP3 gene and its key binding site of ELK1. In the end, the mechanisms that ANO1regulated NLRP3 inflammasome activation in paraquat-induced macrophage would be illustrated, and the valuable new targets for paraquat poisoning therapy will be provided.

NLRP3炎性小体介导百草枯致巨噬细胞活化机制不清。我们研究发现百草枯可以激活巨噬细胞钙激活氯通道ANO1和NLRP3炎性小体以及MEK/ERK/ELK1信号通路；使用ANO1抑制剂可以抑制MEK/ERK/ELK1信号通路及NLRP3炎性小体活化。通过生物学软件预测在NLRP3启动子区域存在着ELK1的结合位点。因此，我们推测ANO1可能通过MEK/ERK/ELK1途径介导百草枯诱导巨噬细胞NLRP3炎性小体活化。本研究将采用基因过表达和沉默技术，明确ANO1对百草枯诱导的巨噬细胞NLRP3炎性小体活化调控作用；采用MEK/ERK/ELK1通路抑制剂明确该通路在此过程中起到的关键作用；采用双荧光素酶报告基因系统，确定ELK1对NLRP3基因的启动作用以及关键结合位点。最终阐明ANO1调控百草枯诱导巨噬细胞NLRP3炎性小体活化的作用机制，为临床上百草枯中毒的治疗提供新靶点。

研究背景：百草枯中毒可以造成肺肝肾等多个器官功能衰竭，且中毒机制复杂并未十分明确。.研究内容：本研究项目主要研究氧化应激反应以及NLRP3小体活化在百草枯中毒过程的分子生物学机制。.重要结果及关键数据：（1）在百草枯导致肾损伤过程中，百草枯可以激活NF-κB，NLRP3炎性小体以及IL-1β 和 IL-18表达；抑制NF-κB可以使NLRP3表达和IL-1β 和 IL-18分泌降低，且能够缓解百草枯引起的DAPK去磷酸化。肾小管上皮细胞DAPK基因敲除以后，NLRP3炎性小体的效应蛋白caspase-1显著下降。由NF-κB 和DAPK调控NLRP3炎性小体激活参与了百草枯导致急性肾损伤。（2）百草枯抑制巨噬细胞活性，产生氧化应激反应，下调TRX/TXNIP复合体功能，NLRP3炎性小体发生活化，抗凋亡蛋白BCL-2减少而凋亡蛋白Bax表达增加，caspase-3活化表达增加；使用水飞蓟素预处理以后，可以显著逆转百草枯所导致巨噬细胞毒性反应。水飞蓟素可以从调节Trx/TXNIP复合体功能，抑制NLRP3炎性小体激活以及抗凋亡等三个方面对百草枯所引起巨噬细胞毒性反应产生保护作用。（3）百草枯导致肝细胞内损伤和氧化应激反应，降低GSH/GSSG比值，促进Nrf2发生核转移；NaHS可以使Keap1 发生二硫键的水解反应，进一步促进Nrf2核转移，引起抗氧化酶表达增加。百草枯可以降低SIRT3和IDH2表达，NaHS可以使SIRT3发生二硫键的水解反应提高IDH2活性。NaHS抑制百草枯导致的NLRP3炎性小体活化。Nrf2基因干扰后，NaHS不能对百草枯导致肝损伤产生保护性作用。硫化氢可以通过调节氧化应激、线粒体功能以及抑制NLRP3炎性小体活化对百草枯导致肝损伤产生保护作用。（4）百草枯诱导人巨噬细胞膜蛋白ANO1表达增加，并导致细胞内NLRP3表达增加、MEK1/2和ERK1/2磷酸化以及ELK1表达增加。在ANO1蛋白抑制以后，上述效应明显减弱。通过荧光素酶报告基因发现在NLRP3上游启动子存在ELK1的结合位点。ANO1可以通过激活MEK/ERK/ELK1信号通路调控百草枯诱导巨噬细胞NLRP3炎性小体活化。.科学意义：本项目研究调控NLRP3炎性小体相关分子在百草枯中毒过程中的作用机制，为寻找百草枯中毒治疗新靶点提供依据。