利用外显子测序技术筛查颈椎后纵韧带骨化新致病突变及其功能研究

Ossification of the posterior longitudinal ligament (OPLL) leads to neurological dysfunction. Multiple genetic components contribute to the development of OPLL. Due to the limitations of traditional detection methods, specific genetic determinants in most of the OPLL patients remain unknown. We performed targeted capture and high throughput sequencing for 10 probands from 10 families with OPLL and 55 sporadic cases to identifiy the novel pathogenic variants of reported pathogenic genes. In 3 families with no variants in reported pathogenic genes, we performed whole-exome sequencing and a gene associated with calcification and bone mineralization was detected in a family. Further studies are needed to screen pathogenic genes in a large number of cases with family history and sporadic cases as well as the normal people in Chinese han population, and genotype-phenotype correlation will be studied. Real-time Quantitative PCR, Immunohistochemical studies and western blot will be explored to demonstrate the genes distributed in the ossification site. The function of the novel variants in the pathogenesis of OPLL will be explored by infecting recombinant adenovirus expression vector into 293T cells . Gene knock out/knock in mice will be made by CRISPR/Cas9 technique to explore the novel gene's function. The purpose of this study is to look for and validate novel pathogenic genes associated with OPLL and provide new targets for the prevention and treatment of OPLL.

后纵韧带骨化（OPLL）可导致神经功能障碍，其发病与遗传因素有关。受传统检测方法的限制，大多数OPLL患者的致病基因不清。我们前期应用目标基因测序技术，对10例OPLL家系先证者和55例散发患者进行OPLL已知致病基因检测，筛查新致病位点。并对3个没有已知致病基因突变的OPLL家系进行全基因组外显子测序，通过生物信息学分析，筛选出了一个与骨质钙化相关的新候选致病基因。本课题将进一步扩大样本量，应用外显子测序技术筛查OPLL致病基因在中国汉族人群中的分布，发现新的致病突变和新的致病基因，研究基因型和临床表型的相关性。在骨化后纵韧带组织中研究致病基因的表达和分布特点；在细胞中过表达含新致病突变的基因，研究突变位点功能；并利用CRISPR/Cas9技术制备新致病基因敲除/敲入小鼠，研究新致病基因在OPLL中的作用，从而进一步揭示OPLL发生机制，为其有效防治提供新理论和药物新靶点。

后纵韧带骨化（OPLL）可导致神经功能障碍，其发病与遗传因素有关。受传统检测方法的限制，大多数OPLL患者的致病基因不清。我们建立了OPLL临床样本库，收集后纵韧带骨化家系样本50个、散发样本200例，汉族正常对照500例。我们选取5个没有已知致病基因突变的OPLL家系进行全基因组外显子测序，首次发现了PTH1R基因的1个新的罕见变异在OPLL家系中共分离，PTH1R变异可引起软骨发育不良、牙萌出障碍等，但没有引起OPLL的报道。另外我们对5例OPLL患者骨化的后纵韧带、邻近组织未骨化的后纵韧带进行了DIA模式下的蛋白质组学分析，发现有9个蛋白在骨化后纵韧带组织中显著上调（上调倍数>2，P<0.05），其中5个蛋白功能与骨发生、骨形成相关，包括COL2A1, MGP, SCUBE1, OMD and FGFBP2。进一步对93例散发OPLL患者进行全基因组外显子测序，并与500例汉族正常人的全基因组外显子进行比较，发现多个OPLL已知基因的新变异位点，在93例患者中发现1例患者存在新的PTH1R罕见变异、5例患者存在新的SCUBE1罕见变异。在500例汉族正常人中没有发现PTH1R的罕见变异，仅发现3个SCUBE1变异，与OPLL患者有显著差异。研究各致病突变阳性/阴性病例及正常对照间临床指标间的差异，发现有变异的患者和无变异患者OPLL分型不同，已知基因变异的样本后纵韧带骨化发生的范围更为广泛，临床多以连续型、节段型和混合型为主，而没有发生已知基因突变的样本临床多以局灶型为主。选择1个PTH1R罕见变异位点和1个SCUBE1的罕见变异，利用CRISPR/Cas9技术制作基因敲入小鼠，研究新的候选致病基因PTH1R和SCUBE1的致病机制。本研究发现了新的与OPLL发病相关的基因，进一步揭示了OPLL发生机制，为其有效防治提供了新理论和药物新靶点。