甘蓝型油菜萎蔫突变体Bnlew1基因克隆及分子机理研究

Plants become wilted because of the water imbalance caused by drought or salinization, the plant leaves curved, and the upper stem bent in worse conditions. A dominant wilty mutant (Bnlew1) was found by EMS treated Zhongshuang11 seeds, which shows wilty phenotype under normal field condition. We proposed that the wilty phenotype was caused by the intense transpiration because of the increased stomatal density based on the water physiology, antanomy and transcriptome et al. analysis. The mutant locus was mapped to 10 possible regions, covered by 5.04Mb by Mutmap. Our research include: 1) Fine mapping and cloning BnLEW1 gene by the sequence alignment of mutant bulk genome sequence with the 608 lines resequence to identify the unique SNP/InDel and by recombinant plants identification; 2) Analyze BnLEW1 expression profiles and subcellular location by fusion BnLEW1 promotor and CDS to reporter gene GUS and YFP, respectively. 3) Gene function analysis will be conducted by CRISPR-Cas9 gene edit technology and gene complementation test. 4) Physiological analysis and drought tolerance test of the transgene lines. The research results will provide us the theoretical foundation in rapeseed breeding concern about the drought tolerance and high water use efficiency.

植物萎蔫通常是由于干旱或盐碱导致植物体内水分代谢失衡，叶片卷曲、上部下垂。我们利用EMS处理中双11号种子获得一个在正常生长条件下发生萎蔫的显性突变体植株(Bnlew1)。我们推测可能是由于突变体植株气孔密度增加，蒸腾作用增强导致植株过度失水而萎蔫，并响应干旱胁迫代谢途径。通过MutMap方法已将突变位点定位到10 个可能区域，总跨度为5.04 Mb。本项目拟：1)通过突变体植株混合池测序结果与608份甘蓝型油菜重测序结果比对寻找突变体混合池特有的SNP/InDel位点及对交换单株进行分析精细定位并克隆BnLEW1；2) GUS融合BnLEW1启动子及YFP融合BnLEW1的CDS，分析BnLEW1表达模式和亚细胞定位; 3)进行功能互补实验并利用CRISPR-Cas9方法进行功能缺失验证; 4)对转基因材料进行分子生理生化与耐旱性分析。项目研究可从不同的角度为油菜耐旱性育种提供理论基础。

干旱胁迫已成为威胁油菜产量的重要因素之一，油菜生长中受干旱胁迫的原因主要有两种，一种是受土壤干旱、盐分等环境因素影响，另一种可能是植物自身原因如根系缺乏、水分运输障碍和气孔运动等。目前在油菜中还未见关于水分运输限制导致干旱胁迫的相关报道。本研究以甲基磺酸乙酯（EMS）诱变处理中双11获得的甘蓝型油菜萎蔫突变体为材料开展遗传学、生理学、解剖学和分子生物学研究。通过BSA-Seq对突变位点进行初步定位，并在定位区间内设计SSR引物和InDel引物精细定位，最终确定候选基因。突变体Bnlxv1在晴天出现萎焉表型，且该性状是由单基因显性杂合突变所致。 离体叶片染料示踪观察，发现突变体叶片吸水速率明显慢于野生型。叶柄横切观察发现，突变体叶柄木质部导管数量比野生型显著增多，但单个导管直径明显小于野生型。其次对野生型和突变体的茎秆、上胚轴、主根的木质部进行观察，发现与叶柄导管类似，突变体导管小而多。但对上胚轴导管解离观察，发现突变体导管次生壁加厚方式与野生型一致，均具有螺纹、梯纹、网纹和孔纹类型导管。但不能形成大直径导管。选择F2中Ⅲ等级萎焉植株和正常表型植株分别构建DNA混池用以BSA重测序，将候选基因定位于C05染色体的0.04-4.11Mb之间。在BSA重测序获得的候选区间内开发新的SSR引物和InDel引物，筛选具有多态性的标记，最终将候选区间缩小到标记InDel29与InDel34区间，该区间大小为121.8Kb。区间内BnaC05g02660D编码IAA12，已有报道Aux/IAA与维管分化有关，因此扩增该基因编码区，发现突变体发生了单核苷酸突变，该突变导致184位氨基酸由E突变为G，该氨基酸处于IAA保守结构域的第Ⅳ结构域上，因此推测该基因为引起突变表型和大导管缺失的候选基因，目前正在对该基因功能和机制开展分析。