环二鸟苷酸合成酶LchD调控产酶溶杆菌抗真菌产物HSAF生物合成的机制研究

Lysobacter enzymogenes is an environmentally friendly and important biocontrol agent. HSAF is a kind of secondary metabolite antimicrobial substance produced by L. enzymogenes with broad-spectrum antagonistic activity against many pathogenic fungi and oomycetes. Thus, HSAF has the potential application as a bio-pesticide. However, the low production of HSAF limits its industrialization. At present, obtaining HSAF high yield strains by genetic modification based on its regulation mechanism is an effective method to increase HSAF yield. We have recently identified a c-di-GMP synthase LchD, which negatively regulates HSAF biosynthesis in L. enzymogenes OH11, but its regulation mechanism is unknown. The second messenger c-di-GMP is a hotspot in bacteria research in recent years. It can regulate pathogenicity, biofilm formation, cell cycle and other important physiological and biochemical functions in pathogenic bacteria, while less is known in biocontrol bacteria, especially for regulation in secondary metabolic antimicrobial substances. To this end, we will use bioinformatics, genetics and molecular biology to study the function of LchD in c-di-GMP synthesis and HSAF biosynthesis, to identify a LchD-c-di-GMP-receptor signaling pathway and to demonstrate the molecular mechanism of LchD in regulating HSAF biosynthesis. The results not only can reveal the molecular mechanism of c-di-GMP regulating secondary metabolites, but also provide theoretical basis for obtaining HSAF high yield strains for genetic improvement.

HSAF是生防细菌产酶溶杆菌产生的一种对病原真菌、卵菌具有广谱拮抗活性的次级代谢抗菌物质，具有被开发为生物农药的潜力，但产量低限制了其产业化发展。在明确其调控机制的基础上，通过遗传改良获得高产菌株是目前提高HSAF产量的有效方法。申请者近期从产酶溶杆菌OH11中发现了一个负向调控HSAF生物合成的环二鸟苷酸(c-di-GMP)合成酶LchD。c-di-GMP是细菌中的新型第二信使，参与调控病原细菌致病性、生物膜合成等重要生理生化功能，但对生防细菌中抗菌物质调控方面的研究较少。因此，本课题将综合运用生物信息学、遗传学和分子生物学等手段，研究LchD的生物学功能，鉴定LchD介导的c-di-GMP调控HSAF合成的信号通路，解析LchD调控HSAF生物合成的分子机制。课题研究成果不仅可以揭示c-di-GMP调控次生代谢抗菌物质的分子机制，也将为遗传改良获得HSAF高产菌株供理论依据。

HSAF是生防细菌产酶溶杆菌产生的一种对病原真菌、卵菌具有广谱拮抗活性的次级代谢抗菌物质，具有被开发为生物农药的潜力，但产量低限制了其产业化发展。在明确其调控机制的基础上，通过遗传改良获得高产菌株是目前提高HSAF产量的有效方法。前期研究发现产酶溶杆菌OH11中一个第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）的合成酶LchD负向调控HSAF的生物合成但具体分子调控机制未知，本课题即对此进行了深入研究。研究首先明确了LchD自身的c-di-GMP合成酶功能并定位到了关键的酶活中心GGDEF氨基酸位点，并通过氨基酸定点突变实验明确LchD的c-di-GMP合成酶功能参与了其对HSAF的生物合成调控；通过转录组测序及c-di-GMP的提取检测实验，发现LchD并非全局性c-di-GMP合成酶，而是一个只调控某特定空间c-di-GMP浓度的酶（Local c-di-GMP signaling）；深入研究发现LchD与前期已知的c-di-GMP降解酶LchP位于同一c-di-GMP信号通路中，共同平衡局部空间的c-di-GMP浓度，并将c-di-GMP信号通过物理互作传递给下游c-di-GMP受体转录因子Clp，通过影响Clp与HSAF关键合成基因启动子区的结合，最终实现对HSAF产量的调控。以上研究结果完善了c-di-GMP调控次生代谢抗菌物质HSAF生物合成的分子机制，是对细菌研究中c-di-GMP调控功能及作用方式的知识扩充；另一方面可以为通过对此信号通路中的关键因子进行遗传改良从而实现抗菌物质HSAF的产量提升提供理论依据。项目执行期内，发表SCI论文1篇，申请国家发明专利1项，完成项目约定的考核指标。