A-RAF激酶在PARP-1介导的细胞凋亡中的作用机理研究

The prevalence of neurodegenerative diseases is increasing rapidly with the growing trend of our aging population. PARP-1-mediated apoptosis (parthanatos) is one of the major types of cell death, and it is evident that parthanatos plays a significant role in the occurrence and development of various diseases, particularly neurodegenerative diseases. Cumulative research has demonstrated that PARP-1 indirectly causes chromatin condensation and DNA breaks in a AIF-dependent manner, finally resulting in cell death. However, the contributions of other proteins to parthanatos are unclear or have a considerable controversy. RAF kinases are one of key components in the major signaling pathway RAS-RAF-MEK-ERK, and A-RAF is one of three members of RAF family kinase. Our preliminary results demonstrated that A-RAF highly bound to both PARP-1 and AIF. Through A-RAF over-expression or knockout, we found that A-RAF could significantly promote PARP-1-mediated apoptosis. In this project, we will observe the effects of A-RAF on PARP-1 and AIF functions, and explore the mechanism by which A-RAF kinase regulates PARP-1-mediated apoptosis through controlling A-RAF expression levels. We will also identify other key regulatory proteins involved in parthanatos by using Crispr/Cas9 for genome-scale screens. This work will demonstrate the role of A-RAF in PARP-1 mediated apoptosis, clarify the mechanism of parthanatos. Ultimately， this study will give new insight into the diagnosis and treatment of parthanatos-related diseases, particularly neurodegenerative diseases.

随着我国人口老龄化加剧，神经退行性疾病的患病率也逐渐升高。PARP-1介导的细胞凋亡(parthanatos)是细胞死亡的重要形式之一，其在神经退行性疾病的发生发展过程中发挥重要作用。目前研究表明PARP-1间接通过AIF导致细胞死亡，但对此具体细胞死亡过程中所涉及的其它蛋白分子尚不清楚。A-RAF是RAF激酶家族的三个重要成员之一。我们前期研究结果显示，A-RAF与PARP-1和AIF均高度结合，且A-RAF可显著促进PARP-1介导的细胞凋亡。本研究拟通过调控A-RAF表达水平，来观察其对PARP-1和AIF功能的影响，探讨A-RAF在PARP-1介导的细胞凋亡中的具体作用机制，同时利用Crispr/Cas9技术在基因组层面筛选parthanatos死亡通路中的其它关键调控蛋白。通过该研究阐明A-RAF在parthanatos通路中的作用机理，为神经退行性疾病的诊断和治疗开辟新的思路。

多聚ADP核糖聚合酶1(Poly(ADP-ribose) polymerase-1，PARP-1) 介导的细胞凋亡(又称parthanatos)是细胞死亡的重要形式之一，其在神经退行性疾病的发生发展过程中发挥重要作用。目前研究表明PARP-1间接通过凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)导致细胞死亡，但对此具体细胞死亡过程中所涉及的其它关键调控蛋白尚不清楚。A-RAF是RAF激酶家族的三个重要成员之一。我们前期研究结果显示，A-RAF与PARP-1和AIF均高度结合，且A-RAF可显著促进PARP-1介导的细胞凋亡。.在本项目中，我们研究了A-RAF激酶对PARP-1介导的细胞凋亡的影响，A-RAF激酶对PARP-1和AIF功能的影响，同时利用Crispr/Cas9技术，在基因组层面筛选PARP-1介导的细胞凋亡通路的其它关键调控蛋白。.我们在H1299和HeLa细胞中分别构建了A-RAF过表达和A-RAF基因敲除细胞系。在parthanatos凋亡诱导剂MNNG处理的条件下，观察了A-RAF表达水平对H1299和HeLa细胞增殖的影响，发现A-RAF可显著促进MNNG所诱导的parthanatos的发生。进一步研究表明，A-RAF过表达可促进H1299和HeLa细胞中parthanatos发生标志物PAR生成水平，及AIF的核转移。AIF的核转移是parthanatos发生的标志性事件。.我们还利用Crispr/Cas9技术和gRNA文库，并结合高通量测序技术，在基因组层面筛选该细胞凋亡通路的其它关键调控蛋白。研究结果显示，在MNNG处理组，处于前25名富集度的gRNAs靶向基因包括PARP-1、AIF和MIF，这三种基因所编码蛋白也是参与PARP-1介导细胞凋亡的重要已知蛋白，A-RAF的gRNA富集度也较高。此外我们还利用免疫共沉淀、蛋白质组学和生信技术，系统识别鉴定A-RAF的结合蛋白谱，并分析A-RAF结合蛋白在细胞主要信号通路和主要功能方面的富集情况，间接反映A-RAF激酶的病理生理功能。.该研究通过系统分析A-RAF的结合蛋白，为全面了解A-RAF功能提供数据支撑。通过阐明A-RAF在parthanatos通路中的作用机理，为神经退行性疾病的诊断和治疗开辟新的思路。