从泛素-蛋白酶体途径研究补肾方治疗慢乙肝的双向调节效应机制及其主体效应中药组

We have confirmed the exact effect of Bushen recipe in treating chronic hepatitis B is based on effective regulation of immune-based multi-links,especially to promote the Toll-like receptor (TLR) 3 and 9 expression mediated anti-inflammatory and the effect of inhibiting the replication of hepatitis B virus. Because of the TLR effect pathway plays a key role in the chronicity of hepatitis B mechanism,and has now confirmed that ubiquitin-proteasome pathway can regulate TLR pathway (degradation of MyD88 to inhibit inflammatory factor production,activation of TBK1 to produce interferon),ultimately mediates anti-inflammatory and antiviral effect.So we put forward the hypothesis 'By ubiquitin-proteasome pathway,Bushen Recipe can bidirectional regulate the TLR effect pathway and mediate to achieve the anti-inflammatory and antiviral activity'. The HBV transgenic mice (scheme 1:ubiquitin ligase Nrdp1 gene knockout;scheme 2:no knockout) are resulted in immunological liver injury model.With Bushen Recipe and its disassembled prescriptions (kidney-yang, kidney yin,clearing heat and humidity) intervention,then with TLR3\9 in vitro stimulation of hepatic Kupffer cells,relations between the final effect of key protein was observed in cells,phosphorylation and ubiquitination of TLR pathway was tested,from both positive and negative aspects to confirm the hypothesis,while to clear Bushen Recipe's main effect prescription.Expected to further clarify the role of Bushen Recipe,and providing the basis for optimizing prescription to improve the curative effect.

课题组已证实，补肾方治疗慢乙肝疗效确切是基于多环节的免疫调控，尤其是能促进Toll样受体（TLR）3和9表达而介导抗炎和抑制乙肝病毒复制的双重效应。由于TLR效应通路在乙肝慢性化机制中起关键作用，而目前证实泛素-蛋白酶体途径能双向调节TLR通路（降解MyD88抑制炎症因子产生，激活TBK1促生干扰素），最终介导抗炎和抗病毒效应。据此提出"补肾方可能通过泛素-蛋白酶体途径，双向调节TLR效应通路而实现抗炎和抗病毒作用"的假说。拟利用HBV转基因小鼠（方案1：泛素连接酶Nrdp1基因敲除；方案2：未敲除），造成免疫性肝损伤模型。经补肾方及其拆方（补肾阳、补肾阴、清化热湿）干预后，用TLR3\9体外刺激肝枯否氏细胞，观察细胞中关键蛋白的泛素化、磷酸化与TLR通路的最终效应的关系，从正反两方面证实假说，同时明确补肾方中的主体效应中药组。预期进一步明确补肾方作用环节，并为优化处方以提高疗效提供依据。

本研究是在系列前期研究基础上，对临床疗效确切的补肾方的免疫效应机制进行深入探讨，同时通过拆方研究，明确补肾方中的主体效应中药组。研究分别利用正常小鼠、HBV转基因小鼠和Nrdp1基因敲除小鼠（采用TALEN技术成功制备），造成刀豆蛋白A诱导的免疫性肝损伤模型，经补肾方及其拆方干预后，观察枯否细胞TLR通路中关键蛋白的泛素化、磷酸化与补肾方的抗肝损伤和抗乙肝病毒效应的关系。.通过研究表明，一方面，补肾方抗肝损伤作用明显，能显著降低各模型小鼠（正常小鼠、HBV转基因小鼠、Nrdp1基因敲除小鼠）急性肝损伤的ALT、AST水平，并提高胆碱酯酶（ChE）表达水平，并在肝组织病理中得到证实。另一方面，补肾方对HBV转基因小鼠的血清和肝组织中HBsAg、HBcAg表达水平无显著作用，但可有效清除肝组织中的HBV cccDNA。.机制探索中发现，补肾方的抗肝损伤作用，与其能显著降低肝损伤模型小鼠NF-κB下游主要的炎性因子IL-6、TNF-α、TNF-β、IL-1的表达水平相关；补肾方的抗乙肝病毒作用，与其能稳定血清中IFN含量有关。尤其对NF-kB及其下游的炎性因子影响显著，这可能是其抗肝损伤作用的主要作用环节。进一步深入的细胞内信号通路研究表明，补肾方对正常小鼠肝枯否氏细胞TLR通路中的泛素-蛋白酶体途径无显著影响，但能显著降低Nrdp-1敲除小鼠肝枯否氏细胞TLR通路中关键蛋白TBK1、IRF3、TLR9、TLR4、TLR3、TRAF6、NFkB、TIRP、myd88的表达水平。这表明，泛素-蛋白酶体途径是补肾方发挥效应的主要通路之一。.此外，通过拆方研究表明，补肾方组方中的各配伍组（补肾阴、补肾阳、清化湿热、引经）能在不同作用环节上起不同主导效应，为全方的抗炎和抗病毒的综合效应发挥协同作用。抗肝损伤作用中，各组均具有一定作用，补肾全组的作用最明显；抗病毒作用中，除引经药组外，其余各组均能显著降低肝组织中的HBV cccDNA含量；在对炎症因子的影响中，补肾阳组中IL-1下降较明显，而补肾阴组中IL-6下降明显；在机制研究中，各组对TLR通路中关键蛋白的泛素化和磷酸化均具有一定的影响，尤其以补肾阳组和清化组的影响最显著。