藏丹参中丹参酮类成分高积累的特异性机制研究

Salvia castanea diels f. Tomentosa stib( Zang Danshen in Chinese) is a native species in Linzhi, Tibet of China. Surprisingly, its tanshinone IIA content is 4-8 times of China Pharmacopoeia standard of Salvia miltiorrhiza. However, the specifical mechanism of high tanshinone accumulation in Zang Danshen is not reported yet. In our previous work, we found that jasmonates signal probably plays an import role in tanshinone accumulation of Zang Danshen. The hairy root of Zang Danshen has been successfully induced in our lab, and its tanshinone IIA content is far more than that in S. miltiorrhiza hairy roots. In this project, S. miltiorrhiza will be used as the control. ①By pot experiment and hairy root culture system, role of tanshinone accumulation and expression pattern of the related key genes in Zang Danshen will be analyzed. Mechanism of different tanshinone accumulation in the two species will be elucidated.②By methods of RNAi and gene overexpression, effects of LOX gene (key gene involved in jasmonates biosynthesis) and JAZ (inhibitor of jasmonates signal) gene on tanshinone accumulation in Zang Danshen will be analyzed. Role of jasmonates signal in high tanshinone accumulation of Zang Danshen will be demonstrated. This research will not only help us understand regulatory mechanism of tanshinone biosynthesis in plants, but also offer us theoretical direction and materials for high quality breeding of Danshen.

藏丹参为西藏林芝地区特有植物，丹参酮IIA含量为紫花丹参《药典》标准的4-8倍，然而其丹参酮类成分高积累的特异性机制，目前尚未有报道。前期研究发现,茉莉酸信号可能在藏丹参丹参酮高积累中起着重要作用，并成功诱导了藏丹参毛状根，其丹参酮IIA含量也远高于紫花丹参毛状根。本项目拟以紫花丹参为对照，①通过盆栽实验和毛状根培养的方法，分析藏丹参中丹参酮的积累规律及其生物合成关键基因表达模式的特异性，揭示紫花丹参与藏丹参丹参酮积累的差异机制，探寻藏丹参特异性高表达基因；②以茉莉酸信号通路调控为重点，通过RNA干扰和基因超表达的方法，研究茉莉酸合成关键基因LOX以及茉莉酸信号抑制因子基因JAZ对藏丹参丹参酮积累的影响，揭示茉莉酸信号在藏丹参丹参酮积累中的调控作用。本项目将为进一步阐明丹参酮的生物合成与调控机制奠定基础，为高品质丹参育种提供理论指导和材料积累。

藏丹参为西藏林芝地区特有植物，丹参酮IIA含量高达《药典》标准的4-8倍，而丹酚酸B含量却极低，关于藏丹参次生代谢的形成机制尚未有报道。本研究首先对对藏丹参和紫花丹参毛状根中丹参酮和丹酚酸积累规律进行了研究发现藏丹参隐丹参酮（CT）、丹参酮IIA（T-IIA）、咖啡酸（CA）和迷迭香酸（RA）含量较高，而紫花丹参二氢丹参酮I（DT-I）和丹酚酸B（SAB）含量较高。其次，发现水解乳蛋白（ LH）对两种丹参的丹参酮生物合成有一定的促进作用，而对丹酚酸积累影响较小。与紫花丹参相比，LH更有利于藏丹参中丹参酮的积累，藏丹参中DT-I、CT、丹参酮I（T-I）和T-IIA积累在诱导后第9 d达到最高水平。LH诱导藏丹参中HMGR、DXR、GGPPS和CYP76AH1更持久的上调。YE能够诱导紫花丹参中DT-I、CT、CA和RA产生，而显著促进藏丹参中DT-I、CT、T-I、T-IIA和CA的积累；Ag+在特定时间增加紫花丹参中CT、T-I、T-IIA、CA和RA的产生，而增加藏丹参中CT、T-IIA、RA和SAB积累；MJ显著促进藏丹参中DT-I、CT、T-IIA、CA、RA和SAB积累，而仅仅影响紫花丹参中DT-I、CT、CA和SAB的产生。进而，对藏丹参和紫花丹参进行了转录组和蛋白组测序分析，结果获得藏丹参高表达片段6897条，紫花丹参高表达片段5506条。进一步分析表明566条差异表达片段为次生代谢相关，其中包括227条CYP基因，81条MYB转录因子和25条WRKY转录因子基因。藏丹参显著高表达蛋白343条，紫花丹参显著高表达蛋白469条，其中次生代谢先关差异蛋白133条。最后，在萜类化合物生物合成途径中，有10个基因在藏丹参中高表达，而31个基因在紫花丹参中高表达。在酚酸类化合物生物合成途径中，有6个基因在藏丹参中高表达，而11个基因在紫花丹参中高表达。P450中有12个基因在藏丹参中高表达，而另有12个基因在紫花丹参中高表达。WRKY转录因子有3个基因在藏丹参中高表达，而1个基因在紫花丹参中高表达。7个MYB转录因子和13个bHLH转录因子基因在藏丹参中高表达。目前正在对这些高表达基因进行功能鉴定，并已经获得转基因株系。本项目初步揭示了藏丹参丹参酮高积累的分子机制，将为进一步阐明丹参酮和丹酚酸的生物合成与调控机制奠定基础，为高品质丹参育种提供理论指导和材料积累。