耐辐射异常球菌疏水蛋白DrwH的作用机制研究

Deinococcus radiodurans is a model extreme microorganism with super resistance to a variety of abiotic stresses. We earlier characterized a novel LEA5C family hydrophobic protein DrwH, which can protect key enzymatic activity in cell metabolism pathway as a molecular chaperone in an ATP-independent manner. And it plays an important role in extreme oxidative stress. However, the mechanism of DrwH is still unclear. We herein propose to employ the following research: 1) Define the expression model for drwH gene under a variety of abiotic stress conditions by qRT-PCR and West Blot. 2) Investigate the transcriptional regulation mechanism of drwH gene by bacterial one-hybrid system combined with EMSA and MST methods. 3) Research on the target enzyme system of DrwH protein using in vitro enzyme protection assays. 4) Comprehensive analysis of molecular mechanism for DrwH protein under stress conditions. In summary, further investigation will be required to elucidate the molecular mechanisms of DrwH protein in D. radiodurans. These findings provide an important theoretical basis for revealing the environmental adaptation mechanism of extreme microorganism.

耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）是一种具有对多种非生物胁迫超强抗性的模式极端微生物。本项目前期在该菌中鉴定了一个新型LEA5C家族疏水蛋白DrwH。该蛋白作为分子伴侣保护细胞代谢途径的关键酶系，在极端氧化胁迫反应中具有重要作用，但目前有关DrwH的作用机制仍不清楚。本项目拟开展如下研究内容：1）实时定量和West Blot分析drwH基因对非生物胁迫的响应，明确drwH基因的表达模式；2）细菌单杂交结合凝胶阻滞和微量热泳动技术研究drwH基因的转录调控机制；3）体外酶活保护实验分析DrwH蛋白作用的靶标酶系；4）综合探讨胁迫条件下DrwH蛋白的作用机理。上述研究有助于阐明耐辐射异常球菌DrwH作用机制，将为揭示极端微生物环境适应机制奠定重要的理论基础。

耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）R1作为抗逆微生物中的模式物种，具有超强抵抗多种非生物胁迫的能力，如辐射、干燥、高温、氧化及化学试剂等。前期在耐辐射异常球菌中鉴定了一个具有疏水特性的LEA5C家族蛋白DrwH，在细胞抵抗氧化和盐胁迫过程中发挥重要作用。本项目在此基础上通过基因诱导表达、转录调控、蛋白结构解析、生理表型分析及体外功能验证等全面阐明DrwH蛋白的作用机制，取得以下研究结果：. （1）实时荧光定量分析显示耐辐射异常球菌drwH基因受不同浓度盐、氧化、高低温等胁迫条件诱导表达，在菌株抵抗逆境胁迫过程中发挥重要作用；（2）调控因子突变株中drwH基因表达量分析表明，胁迫条件下可能受到Sig1、IrrE、CarD、RpoD等调节因子调控；（3）透射电镜和菌株生长表型分析显示drwH基因缺失对细胞中生物大分子造成损伤，影响细胞正常的生理功能，破坏细胞膜的完整性，可能导致细胞合成的色素释放至培养基中使颜色加深变红；（4）采用体外酶活保护实验及MST技术验证疏水蛋白DrwH在胁迫条件下作为分子伴侣保护细胞中关键酶活性（如CAT、LDH、MDH等），证实了DrwH蛋白分子伴侣的广泛性；（5）对DrwH蛋白进行人工截短和重组在大肠杆菌中异源表达，发现DrwH蛋白类信号肽过量表达对宿主细胞生长产生抑制效应，而WHy-Domain是DrwH发挥功能的核心结构域；（6）不同物种的LEA5C蛋白都含有WHy-Domain，通过结构与功能的比较分析证明了结构和来源不同的WHy发挥不同的抗逆功能。资助期内共发表相关学术论文7篇，其中SCI论文4篇，中文核心论文3篇；申请国家发明专利2项，其中授权1项。参加课题相关学术会议4次，培养硕士研究生2名。本项目开展含有WHy结构域的LEA5C家族蛋白在非生物胁迫过程中的作用研究，将有助于阐明耐辐射异常球菌的极端抗性分子机制；异源WHy-Domain作为最小抗逆元器件因其结构和抗逆功能不同，在完善抗逆基因资源库和涉及农业抗逆的合成生物学领域中具有重要应用价值。