转肽酶Sortase A催化的新反应及其在蛋白质修饰中的应用

In the proposed project, we plan to develop a new peptide/protein C-terminal amio acids trans-hydrazidiase reaction which is catalyzed by transpeptidase Sortase A. This reaction could be further applicated in site-specific protein labeling, modification and semi-synthesis. We design to realize series of objective including: ⑴ firstly, Sortase A targeted substrate peptide bearing a "sorting motif" was used as model to realize C terminal peptide hydrazide synthesis under the catalysis of Sortase A in combination with hydrazine. The efficiency of this reaction should be optimized subsequently; ⑵ secondly, Sortase A catalysis peptide hydrazide synthsis should be further expanded to bio-function protein. We aim to realize C terminal protein labeling, modification and semi-synthesis via this new bioorthogonal reaction; ⑶ thirdly, to realize one-step protein labeling and modificaiton, one-step Sortase A catalyzed peptide/protein hydrazide synthesis reaction should be studied by the hydrazinolysis of a Sortase A formed thioacyl intermediate; ⑷ finally, based on aforementioned new reaction, we aim to realize one-step site-spectific therapeutic protein modification in physiological condition. Thus, the medicinal value of therapeutic protein should be increased by substantially improved solubility and stability, increased the half-life of the protein in vivo as well as masking potentially immunogenic epitopes.

本项目拟发展转肽酶Sortase A催化的新型多肽/蛋白质末端氨基酸转酰肼化反应并将其应用于蛋白质的定点标记、修饰及半合成。具体课题设计及拟实现目标主要包括：⑴ 以C端含有Sort A识别序列（LPXTG等）的多肽为模型，在外加Sort A与亲核试剂（水合肼）的条件下得到C端转化为酰肼末端的目标多肽并筛选最佳转化条件，实现末端多肽酰肼的酶促合成；⑵ 将多肽酰肼的酶促合成应用于功能蛋白，并实现蛋白质的C端标记、修饰及半合成；⑶ 研究Sort A催化的多肽/蛋白酰肼的一步法酶促合成，发现转肽酶硫脂中间体能被取代水合肼肼解，实现一步法的标记和修饰；⑷ 基于上述方法实现在生理条件下蛋白质药物的一步法修饰和标记，在保持其药用活性的前提下改善水溶性和酶稳定性，最终达到提高其医药学价值的应用目标。

随着生物医学和化学生物学的快速发展，发展与生理条件兼容的生物正交标记、连接方法以完成蛋白质标记、修饰或化学合成，从而得到含有翻译后修饰或非天然成分的功能化蛋白质分子成为当今化学生物学的前沿热点问题。在本项目的支持下，主要开展了三个方向的研究内容：a. 发现转肽酶Sortase A 催化的蛋白质酰肼合成新反应，建立了蛋白质酶促半合成新方法体系；b. 运用该策略合成了系列重要翻译后修饰蛋白，并阐明其动态调控的生物化学机制，包括乙酰化Atg3通过增强与含有PE脂质体的结合进而促进Atg8脂化过程的新学说、双磷酸化修饰自噬受体蛋白p62与泛素链的双齿结合新模式等；c. 合成了其他多种类型重要蛋白质分子，包括二泛素及泛素探针、二氨基二酸合成多肽药物催产素、毒素蛋白Manbalgin-1及APET×2等。目前由本课题组发展的酶促蛋白质半合成新方法已得到国际学术界和工业界的广泛应用。