棉铃虫ABCG1介导的Bt杀虫功能分析

Research of Bt (Bacillus thuringiensis) functional mechanism on taget pest will supply directions on monitor and management of Bt resistance. ABCC2 (ATP-Binding Cassette Sub-Family C Member2) is key receptor of Bt toxins in Lepidoptera, and new research reported that ABCA2，ABCC3 and ABCG1 had important roles in Bt insecticidal actions in Helicoverpa armigera, Spodoptera litura and Plutella xylostella respectively. This research will clone the full length of ABCG1 in Helicoverpa armigera, and restructure eukaryotic expressional vector to transfect Hi5 cells. Then Cry1Ac and Cry2Ab will be used to treat restructured Hi5 cells to analyzed ABCG1 mediated Bt insecticidal action. We will down-regulate expression of ABCG1 with RNAi and make bioassay with Cry1Ac and Cry2Ab to prove the function of ABCG1 in mediating insecticidal action of different Bt toxin. This project will make important contributions to Bt functional research and new finding of Bt resistant mechanism.

靶标害虫Bt作用机理的研究将为Bt抗性的监测与治理提供重要的理论指导。ABCC2是鳞翅目昆虫重要的Bt毒素受体，最新的研究发现其他三种ABC转运体，ABCA2，ABCC3和ABCG1分别在棉铃虫、斜纹夜蛾和小菜蛾里参与介导Bt毒素的杀虫功能。本项目拟以重要的Bt靶标害虫棉铃虫为研究对象，通过基因克隆获得ABCG1基因的全长序列，构建真核表达载体转染Hi5细胞系，用Cry1Ac和Cry2Ab处理细胞，分析ABCG1介导不同毒素的穿孔作用；进一步在棉铃虫体内利用RNAi的方法下调表达ABCG1，通过Cry1Ac和Cry2Ab两种毒素的生测实验验证目标基因参与介导不同Bt毒素杀虫的功能。本项目将综合以上两个方面的工作，深入解析ABC 转运体重要成员ABCG1识别并介导Bt毒素杀虫的机制，为Bt毒素作用机理的研究和可能的新Bt抗性机制发现做出重要贡献。

Bt作物长期种植导致一些害虫产生了抗性，小菜蛾Plutella xylostella对Cry1Ac毒素的抗性和white（ABCG1）基因下调表达显著相关，据此推测棉铃虫Helicoverpa armigera的HaABCG1基因下调表达很可能与Cry1Ac抗性同样存在内在联系。通过基因克隆获得HaABCG1基因的全长序列，构建真核表达载体转染Hi5细胞系，用Cry1Ac毒素处理细胞，分析HaABCG1是否介导Bt毒素的穿孔作用；进一步在棉铃虫体内利用RNAi的方法下调表达HaABCG1，通过Cry1Ac毒素的生测实验验证目标基因是否参与介导Bt毒素杀虫的功能。生物信息学分析表明HaABCG1基因的ORF含1896个核苷酸，编码631个氨基酸，棉铃虫ABCG1蛋白没有信号肽和O-糖基化位点，含4个N-糖基化位点，1个核苷酸结合结构域NBD和1个跨膜结构域TMD。系统进化分析显示，不同物种间ABCG1转运蛋白存在很高的相似度，其中，棉铃虫ABCG1和斜纹夜蛾Spodoptera litura的ABCG1相似度最高。亚细胞定位分析表明HaABCG1蛋白主要位于核膜和内质网上，细胞毒力实验证明HaABCG1蛋白不介导Cry1Ac毒素对Hi5细胞的毒力，HaABCG1不是Cry1Ac毒素的受体，也不是Cry1Ca、Cry2Aa和Cry1Fa的受体。RNAi和生物测定发现HaABCG1下调表达的棉铃虫品系不能在0.05μg/mL Cry1Ac毒素的人工饲料上正常生长，处理组和对照组幼虫体重变化差异不显著。体内和体外两方面的研究结果表明，棉铃虫ABCG1基因的下调表达与棉铃虫Cry1Ac抗性无关，棉铃虫ABCG1蛋白不是Cry1Ac毒素的受体。这是首次报道HaABCG1基因不参与棉铃虫Cry1Ac抗性。相关实验方案以及研究结论可为更深入探索棉铃虫以及其他重大农业害虫Bt抗性机制提供参考。