可溶性pMHC二聚体对实验性自身免疫性心肌炎的研究

Cardiac myosin-specific T cells are the main reason for the persistence of myocardial injury. Conventional immunosuppression can improve the symptoms of myocarditis while increasing the risk of other diseases.To explore more effective immunotherapy strategies, inducing antigen-specific T cell tolerance is particularly appealing. Studies have shown that soluble pMHC dimer binds with high affinity to TCR, which can effectively inhibit the function of antigen specific T cells. Experimental autoreactive myocarditis (EAM) is an autoimmune disease and has been used as a model for human myocarditis. CD4+ T cell recognizes the epitope of cardiac myosin peptides 614-629(CM614-629) in the model, which induces an immune response and causes tissue damage. This study intends to establish antigen peptide CM614-629-induced EAM model with BALB/c, and produce the soluble pMHC dimer which can bind CM614-629 antigen specific CD4+ T cells. The pMHC dimer induces autoreactive T cell anergy in mice of EAM and ameliorates the symptoms of myocarditis thereby providing strategies for the clinical treatment of myocarditis and cardiomyopathy.

心肌肌球蛋白特异性T细胞是心肌炎心肌损伤持续存在的主要原因，常规的免疫抑制治疗在一定程度上可以改善心肌炎患者的症状，但免疫抑制剂的长期应用增加了罹患其他疾病的风险，因此，探索更有效的诱导自身抗原特异性T细胞耐受的方法显得尤为突出。小鼠实验性自身反应性心肌炎（EAM）是人为诱发针对心肌的自身免疫性疾病模型。在抗原肽CM614-629诱导的BALB/c小鼠EAM模型中，CD4+T细胞识别CM614-629抗原表位，可诱导CD4+T细胞免疫应答，造成组织损伤。研究表明，可溶性pMHC二聚体可以与TCR高亲和力结合，有效的抑制抗原特异性T细胞的功能。本研究拟建立抗原肽CM614-629诱导的BALB/c小鼠EAM模型，制备与抗原肽CM614-629特异性CD4+T细胞特异性结合的可溶性pMHC二聚体，在EAM小鼠体内诱导自身反应性T细胞无能，改善小鼠EAM症状，为临床心肌炎心肌损伤的治疗提供策。

本课题首先利用RT-PCR等一系列方法构建杆粒病毒Bacmid+[I-Ad/IgG2b Fc]，利用脂质体转染试剂将重组表达载体转染至Sf9昆虫细胞，P4后大量感染Sf9昆虫细胞，收集上清通过PEG20000浓缩可得到I-Ad/IgG2b Fc二聚体融合蛋白，通过双抗体夹心ELISA及Western-blot对表达的蛋白进行检测。PCR及酶切鉴定以及测序结果证实所构建的pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc]重组载体具有正确的序列；双抗体夹心 ELISA和Western-blot结果表明重组杆粒能成功感染Sf9昆虫细胞，并且表达的融合蛋白具有正确构象。.本课题利用抗原肽CM614-629联合完全弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠，建立EAM动物模型。在体外实验中，CCK-8检测CM614-629抗原肽及可溶性I-Ad二聚体作用于细胞最佳浓度，结果显示，最佳CM614-629抗原肽浓度为20μg/ml，且400ng/ml 的I-Ad二聚体可显著抑制CM614-629特异性T细胞的增殖；在体内实验中，我们利用10倍于体外实验摸索的二聚体浓度最佳剂量，即4μg/只行动物体内注射，ELISA结果显示，与对照组比较，I-Ad二聚体可以显著降低促炎细胞因子水平，如IFN-γ和IL-2；与对照组比较，I-Ad二聚体可以显著提高抑炎细胞因子水平，如IL-4和IL-10。心肌组织HE染色结果显示，对照组心肌中，淋巴细胞浸润明显，实验组心肌中浸润情况与空白组基本一致。.本课题按年度计划完成了课题设计中的各项任务，培养了硕士生3名，已资助发表文章2篇，并在随后两年内发表SCI论文1篇，中文核心2篇。