白斑综合症病毒 siRNA 的发生机制和功能研究

Small interfering RNA (siRNA) is a class of non-coding small RNAs of 21-25 nucleotides long. It can degrade mRNA with complementary nucleotide sequences via the RNA interference pathway, and plays critical roles in virus-host interplay. Currently, the theories for siRNAs biogenesis of DNA viruses are still inconclusive. White spot syndrome virus (WSSV) is a unique DNA virus which has caused serious losses in shrimp aquaculture. Our recent research showed that various viral siRNAs were produced during WSSV infection. Analysis following the previous work has found WSSV siRNAs which match perfectly to shrimp genes involved in anti-virus defense, which inspires a hypothesis that WSSV may usurper the RNAi mechanism against the host’s defense. We plan to illuminate the biogenesis mechanism of siRNA by strand-specific RNA-seq, silencing of Dicer-2 and injection of synthetic siRNA precursors. We will also verify siRNA function by inhibition of the WSSV siRNAs, or by knocking down the host target sequences of the siRNAs. This project will shed new light on the function of viral siRNAs in WSSV infection. In addition, identification of host target sequences of WSSV siRNAs will provide valuable information for the genetic enhancement of shrimps.

小干扰RNA（siRNA）是一类长21-25nt的非编码小RNA，它通过RNAi通路降解与其序列匹配的长链RNA，在病毒-宿主相互作用中具有重要作用。目前对DNA病毒siRNA的发生机制尚无定论。白斑综合症病毒（WSSV）是一种具有独特生物学特征的DNA病毒，对对虾产业有重大危害。申请人的前期工作发现WSSV能够表达多种siRNA，而WSSV某些siRNA与宿主重要免疫基因序列完全匹配，这提示WSSV可能利用siRNA抑制宿主的抗病毒反应。据此，本项目拟通过链特异性RNA-seq、沉默Dicer-2基因、以及通过注射合成的siRNA前体重现其发生过程等方法探讨其发生机制；进一步通过对siRNA的抑制或对siRNA对应的宿主靶标序列进行基因敲除等手段验证其功能。本项目将为阐明siRNA在WSSV感染宿主过程中的作用提供理论基础，此外，宿主靶标序列的鉴别将为养殖品种的遗传改良提供重要信息。

RNA干扰（RNAi）是由siRNA或miRNA介导的基因沉默现象。由于RNAi能够降解某些病毒复制必需的双链RNA，因此具有重要的抗病毒免疫作用。白斑综合症病毒（WSSV）是危害水产动物的重要病原，自九十年代初以来，已经在全球范围内造成了巨大经济损失。近来我们发现WSSV能够产生多种siRNA和miRNA，但是其发生机制和功能尚不明确，特别是没有找到WSSV siRNA发生的底物（双链RNA）以及关键酶（RNA依赖的RNA聚合酶，即RdRp）。.本项目通过链特异性全转录组测序寻找病毒双链RNA，并将其表达模式与病毒siRNA相比较，分析双链RNA是否为siRNA发生的底物。通过全转录组测序寻找RNAi级联放大的关键酶RdRp，分析其来源及进化地位。通过比较病毒siRNA在不同组织的表达水平，找到宿主RNAi抗病毒免疫的关键器官。我们还分析了miRNA在基因组中的分布特征，及其对miRNA的表达、进化和功能的影响。.项目研究发现，WSSV siRNA发生的关键组织是血细胞。WSSV感染宿主的过程中会表达355种反向互补的mRNA，这些mRNA之间能够形成双链RNA，成为诱发RNA干扰的底物。在感染WSSV的宿主转录组中鉴定出了两种RdRp基因，值得特别关注的是，这两种RdRp既不属于WSSV，也不是宿主编码的，而是来自两种RNA病毒，两种病毒均为未报道过的新种，其中一种负链RNA病毒归为Alphacrustrhavirus属，而一种正链RNA病毒归为Piscichuvirus属。RNA病毒编码的RdRp能够以DNA病毒WSSV的单链mRNA为模板合成双链RNA，作为底物诱导RNAi抗WSSV反应。RNA病毒的拷贝数高于WSSV病毒，但是对宿主没有表现出致病性，提示RNA病毒与宿主可能形成了共生关系。以上发现说明与宿主共生的RNA病毒可以为宿主抗WSSV病毒免疫提供关键酶，解答了WSSV siRNA 发生机制的关键生物学问题，为提高水产动物的抗DNA病毒免疫力提供了理论基础。另一方面，项目发现miRNA基因倾向于在基因组中形成串联的miRNA簇，这种簇状结构能够提高新miRNA的表达量及功能，使其不易在遗传漂变中被淘汰，我们据此提出了一种miRNA基因簇进化发生机制的新模型，称为“功能性表达模型”。