裂殖酵母线粒体转录因子sp_SMTF1的分子调控机制的研究

裂殖酵母线粒体转录因子sp_SMTF1的已知细胞功能是参与线粒体基因组基因的转录，本实验室初步结果表明在裂殖酵母细胞中敲除或过量表达sp_SMTF1会引起细胞形态，生长和分裂的改变，我们在核中发现了sp_SMTF1的表达，推测它很有可能也是核里的一个转录因子，这将是sp_SMTF1新的生物学功能。本项目将采用CHIP-Chip的实验技术在裂殖酵母的全基因组中找到sp_SMTF1所有结合的DNA靶点，确认sp_SMTF1的 DNA靶点（用EMSA），找到DNA靶点的下游基因，检测下游的基因在本实验室已经建立好的sp_SMTF1基因敲除菌株和sp_SMTF1过量表达菌株中表达量的差异（用荧光定量PCR技术)，从细胞形态，生长和分裂，代谢等各个生理层面上挖掘和认识sp_SMTF1在裂殖酵母中的生物学功能，进而绘制以sp-MTF1为中心节点的转录调控网络，将线粒体相关疾病提供理论和实践基础。

本课题组首次分离和鉴定了裂殖酵母线粒体转录组分RNA聚合酶（Rpo41）和转录因子（Mtf1）并在遗传和生化上揭示了Rpo41和Mtf1在线粒体转录中的生物功能。这一研究体系的建立是用裂殖酵母作为新型的模式生物来研究线粒体转录机制的关键的第一步。我们首先构建了Mtf1和Rpo41的敲除菌株。敲除Mtf1 或者Rpo41的细胞不能形成菌落也不能在液体培养基中生长；观察单倍体细胞发现，敲除Mtf1和敲除Rpo41细胞的表型是相似的：细胞变长，出现“酒瓶”或“鸡蛋”的形状。荧光染色后发现敲除Mtf1或者Rpo41后，细胞的横隔分离异常，细胞核异常，线粒体膜电位降低。敲除Rpo41或Mtf1可以使线粒体基因组基因的转录降低，而过表达Rpo41或Mtf1可以使线粒体基因的转录增加。我们表达和纯化了裂殖酵母的Rpo41和Mtf1来进行体外实验。用EMSA的方法证明了Mtf1和Rpo41与线粒体启动子有结合。在体外，Rpo41和Mtf1能转录线粒体启动子，并且Mtf1能提高转录效率。对于体外转录合成的RNA的5’-RACE分析表明，体外转录起始位点和体内是一致的。这些实验结果发表在Nuclear Acid Research （2011 Jul 1;39(12):5119-30）上并且在研究的深度，完整性和创新性上被评为NAR 优秀论文（top 5% featured article）。我们还发现了Mtf1 的一个全新的功能， Mtf1不仅仅是线粒体中的一个转录因子，而且也是核中的转录因子。我们首次发现Mtf1在细胞核内也有表达，我们进一步用ChIP-chip的方法在裂殖酵母全基因组中找到了Mtf1在核中作为转录因子的靶基因，其中Srk1（参与细胞胁迫和细胞周期）是芯片数据中的第一个靶基因。我们接下来用5’RACE确认了Srk1启动子的转录位点，在体外用生化的方法（EMSA）证明了srk1的上游序列在体外和纯化的Mtf1有结合，我们还发现Mtf1的细胞功能可能与细胞周期的调控有关, 这些实验结果也已在Nucleic Acids Research (2011 Apr;39(7):2690-700）发表。我们发现Mtf1作为裂殖酵母线粒体转录因子可以与HSP60分子伴侣相结合来实现其在线粒体中的功能，结果已经发表在Genes to Cells 上发表(2012) 17, 122–131