雌激素受体介导的补骨脂肝毒性研究

Psoralea corylifolia is widly used. In recent years, it was certified that Psoralea corylifolia can induce cholestatic liver injury, and hepatotoxicity of Psoralea corylifolia limits its application. Preliminary studies suggest that psoralen and isopsoralen, estrogen-like substrates, should be the toxicity-components inducing liver inury, and estrogen can cause cholestasis by interfere transportion and of bile acid ,taken together, these suggest that ER?-mediated repression of hepatic transporters and alterations of bile acid biosynthesis may contribute to development of the hepatotoxicity induced by Psoralea corylifolia. In this project, it will be observed the hepatotoxicity of psoralen and isopsoralen in cells and animals, and the changes of mRNA and protein expression involved in bile acid synthesis enzymes (CYP7A1, CYP8B1), nuclear receptors (FXR, PXR) and bile acid transporters (BSEP, NTCP, ASBT) by using PCR, Western Bolt and other molecular methods, to find the first target and the role of link of the toxic effects. Compare differences in effects of psoralen and isopsoralen with or without ER in ER gene silencing and normal L-02 cells, ER gene knockout and normal mice, to confirm the role of ER in the liver injury. Clarify the mechanism of cholestatic liver injury induced by Psoralea corylifolia and provide experimental evidences to the quality control and the safe clinical application.

补骨脂临床应用广泛,近年发现补骨脂可导致胆汁淤积性肝损害，限制其推广使用。前期研究表明雌激素样成分补骨脂素、异补骨脂素是最可疑的肝毒性成分；而雌激素可经雌激素受体（ER）介导而干扰胆汁酸合成转运，长期大量使用可导致胆汁淤积，提示补骨脂的肝毒性可能与其含的雌激素样成分干扰胆汁酸合成转运有关。本项目在细胞和整体动物两个水平观察补骨脂素和异补骨脂素的肝毒性，并应用PCR、Western bolt等生物学技术检测胆汁酸合成酶CYP7A1、CYP8B1，核受体FXR、PXR和转运体BSEP、NTCP、ASBT等的mRNA和蛋白表达的变化，寻找毒性作用的第一靶点、理清作用环节。在正常和ER基因沉默的L-02细胞、基因敲除的小鼠，比较补骨脂素和异补骨脂素在有无ER的情况下毒性作用的差异，确认其肝毒性由ER介导。明确补骨脂造成胆汁淤积的作用机制。为补骨脂的质量控制和临床安全使用提供实验基础。

近年来，补骨脂的肝脏毒性日益受到关注。本课题提出补骨脂导致的肝毒性可能与补骨脂素和异补骨脂素经雌激素受体（ER）导致胆汁酸合成转运失调有关。.体外研究发现，补骨脂素、异素对HepG2细胞毒性的量效曲线平缓，最小毒性剂量小（以IC5计尚不到10 μmol/L），并对胆汁酸排出转运体MRP2、MRP3有显著抑制。而且药材中大量的补骨脂苷和异苷在体内可转化为补骨脂素和异素，导致使用补骨脂药材后补骨脂素和异素的实际血药浓度较高。而补骨脂酚在补骨脂药材含量达3%以上，且有较强的细胞毒性。继而在小鼠体内考察补骨脂素、异素和补骨脂酚的肝毒性，结果表明补骨脂素和异素有明显的肝毒性。异补骨脂素给药2周即可导致小鼠体重降低、肝系数显著升高，血清AST、ALT显著升高，小鼠肝脏内胆汁酸水平显著升高，而且80 mg/kg异补骨脂素可导致小鼠肝细胞大量变性，Western Blot表明肝脏胆汁酸转运体BSEP、MRP2、MRP3、MDR1等显著抑制，结果证实异补骨脂素会抑制胆汁酸排出转运体，导致肝内胆汁酸水平升高，最终引起小鼠肝损伤。补骨脂素20、40、80 mg/kg给药4周，均可引起肝脏重量和肝系数显著升高，同时80 mg/kg补骨脂素组小鼠肝脏内胆汁酸水平升高，肝脏胆汁酸转运体亦不同程度受到影响。而补骨脂酚给药4周，除了80 mg/kg组肝系数有所身高外，血清生化、肝脏病理均未见异常。因此，肝毒性强度为异补骨脂素 > 补骨脂素 > 补骨脂酚。.在HepG2细胞上，通过干扰ERα或ERβ均未能明显抑制补骨脂素和异补骨脂素的体外细胞毒性，但使用ERα阻断剂MPP和ERβ阻断剂PHTPP对补骨脂素和异补骨脂素的体外毒性有一定拮抗作用。并且，补骨脂素和异补骨脂素对ER敲除小鼠（ERα-/-和ERβ-/-）的肝毒性明显较低于，同样给药80 mg/kg，与野生型C57小鼠相比，ERα-/-和ERβ-/-小鼠的肝系数基本正常，血清AST、ALT等有不同程度的降低。结果表明，ERα和ERβ阻断或敲除均可一定程度的降低补骨脂素、异素的肝毒性，但并不能完全消除其毒性作用。综上所述，补骨脂素和异补骨脂素通过ER导致肝毒性，且ERα和ERβ均参与其中。