内生短短芽孢杆菌抑制早疫病菌活性化合物及其作用研究

茄科作物链格孢菌Alternaria solani 引起的番茄早疫病、马铃薯早疫病等是茄科作物最常见的病害之一, 严重影响产量和品质。在前期研究中，申请者筛选了短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis 011菌株（Genbank 登录号DQ444285），采用灌根法施用该菌株的菌液对番茄和马铃薯早疫病防效达到80%以上，并且发现该菌可以在蕃茄体内定殖，且证明它的次生小分子化合物是关键抑菌因子。本课题拟进一步对该菌株进行如下研究：首先，分离纯化011菌株发酵液中的抗菌活性单体，进而，分析其分子结构及其与抑菌活性的关系，接下来将通过代谢调控技术和同位素标记技术探索该活性成份的作用机理。本项目研究的开展，可为农用杀菌剂的研制提供先导结构，促进植物病害生物防治发展。

内生短短芽孢杆菌发酵产物经乙腈处理，制备型HPLC进行分离，得到活性组分8、9、10，HPLC再对活性组分10分离，获得单体活性组分A、B、C、D、E、F，对番茄早疫病菌孢子萌发抑制率分别为100%、100%、100%、100%、97.80%、5.66%。质谱检测活性单体E分子量为664Da。内生短短芽孢杆菌产生的抑菌活性成分至少在10种以上，从质谱结果分析可能为一种含硫化物的新型肽类物质，现正在将上述制备好的大量各个单体成分化合物进行鉴定结构和并解读图谱。采用孢子萌发法测定其活性成分对番茄早疫病菌MIC及,结果表明对番茄早疫病菌最低抑菌浓度MIC为30%，有效抑菌中浓度EC50为9.64%；采用平皿打孔法测定其活性成分抗菌谱及其活性稳定性，结果表明其对番茄早疫病菌等8种植物病原真菌均有抑制作用，其中对番茄早疫病菌抑制作用较强；具有较好的热稳定性，100℃处理1h后，活性保持在95%;酸性((pH2. 0)及紫外线 (20w、30cm照射2h)照射处理后，活性均保持不变。活性成分发酵调控研究明确其最佳培养基为蔗糖5g/L、酵母膏27g/L及氯化钠4g/L；最佳发酵条件为时间48h、温度33℃、接种量3%、装液量80mL/250mL、转速220r/min、初始pH 7. 0。此条件下活性成分提高了26%。用光镜和透射电镜观察其活性成分对番茄早疫病菌菌丝生长和孢子萌发的影响，结果表明其处理的菌丝异常生长，孢子萌发芽管膨大或缢缩；E单体致菌丝细胞膜透性的变化,造成液体培养基电导率增加，菌丝体内液泡增多。