西藏牦牛致病性大肠杆菌毒力因子的分子流行病学及生物学特性研究

牦牛大肠杆菌病是目前危害西藏地区牦牛养殖业的主要传染病之一。本项目拟在牦牛致病性大肠杆菌病原生物学研究的基础上，利用多重PCR技术，全面系统地针对西藏不同地区、不同时间、不同品种等来源牦牛致病性大肠杆菌毒力因子进行分子流行病调查，同时对牦牛致病性大肠杆菌毒力因子相关生物学特性进行初步探索，为西藏地区牦牛大肠杆菌病的早期快速诊断和流行病学调查奠定基础，同时进一步揭示牦牛致病性大肠杆菌的致病机制，从而为西藏地区牦牛大肠杆菌病的免疫防治提供新的思路和科学依据。

本课题以西藏不同地区牦牛源致病性大肠杆菌为研究对象，进行了其生物学特性和毒力因子分子流行病学研究。结果表明（1）西藏牦牛大肠杆菌优势血清型为O78、O26、O115、O158和O148,那曲地区优势血清型为O 78、O148，阿里地区为O158，日喀则地区为O78和O158，林芝地区为O78，山南地区为O148，拉萨为O78 和O115等；（2）多重耐药现象较严重，对头孢唑林、氨苄西林等药物耐药率较高，对卡那霉素耐药程度较低，对氧氟沙星等药物的敏感性较高；检测出对氨基糖苷类药物耐药基因rmtB，氟苯尼考类药物耐药基因flor；磺胺类药物耐药基因sul1、sul2、sul3，且耐药表型与耐药基因检测结果基本一致。（3）成功建立了牦牛大肠杆菌k88、k99 、F41、STa 毒力基因PCR 检测方法，并对16株代表菌株进行了毒力基因检测，结果表明11/16分离菌株毒力基因型为K88、K99、F41、STa；3/16分离菌株毒力基因型为K88、K99、STa；2/16分离菌株毒力基因型为K88、F41、STa，证明西藏牦牛致病性大肠杆菌流行菌株主要毒力基因型为K88、K99、F41、STa。（4）选择16株分离代表菌株进行动物致病性试验，结果均能引起大多数小鼠和家兔死亡，具有高致病性,其中K88、K99、F41、STa和K88、K99、STa两种毒力基因型分离株感染可以引起80%以上小鼠死亡、75%以上家兔死亡。（5）选择分离获得的6株牦牛致病性大肠杆菌代表菌株，进行了毒力基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析，发现6株菌株K99，F41，ST等3种毒力基因核苷酸序列具有较高的同源性，F41，ST等2种毒力基因氨基酸序列具有很高的同源性，说明K99，F41，ST等3种毒力基因遗传稳定性较好；而K88毒力基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性差异性较大，说明6株牦牛致病性大肠杆菌菌株K88毒力基因发生了较大的变异，是否由于时间变化、环境迁移等因素的影响所致，有待于进一步研究。（6）构建16SrRNA系统发育树分析发现，3株与猪源致病性大肠杆菌亲缘关系较近，5株与禽源致病性大肠杆菌亲缘关系较近，2株与犊牛源大肠杆菌亲缘关系较近，4株与牛源大肠杆菌亲缘关系较近；1株牦牛源致病性大肠杆菌单独形成一个较远的分支，1株牦牛源致病性大肠杆菌与人源出血性大肠杆菌、志贺氏菌聚为一支。