产溶剂梭菌“双功能密码子”在转录调控中的作用机制研究

Transcriptional regulation is an important means used by cells to maintain their normal physiological and metabolic activities. Dual-use codons, as a group of peculiar regulatory elements occurring in gene-encoding regions, can both encode amino acids and be bound by transcriptional factors, and thus, are worth deeply exploring. In this project, both bioinformatics and molecular biological techniques will be used to study dual-use codons in Clostridium acetobutylicum, an important industrial microorganism, in which a pleiotropic regulator CcpA will be specially focused on. Through the dissection of the dual use of cre2 in ccpA-coding and mediating transcriptional regulation, the characteristics of cre2 and another CcpA-binding site (cre1) in the upstream non-coding region as well as the cre1-cre2 interacting mechanism, we aim to establish a novel double-sites-based self-regulation model of CcpA. On this basis, the self-regulation mechanism of CcpA based on the dual-use codon will be further studied in some other solventogenic Clostridium species, aiming to elucidating its universality. This study will not only enrich our knowledge on microbial transcriptional regulation but also provide useful clues and strategies for genetic modification of industrial microorganisms.

转录调控是细胞维持正常生理和代谢过程的重要手段。基因编码区内的“双功能密码子”既能编码氨基酸又可被调控蛋白结合，是近年来发现的一类特殊调控元件，其功能和潜在应用价值值得深入探究。本项目将利用生物信息学和分子生物学技术，开展重要工业微生物—丙酮丁醇梭菌的“双功能密码子”研究，重点关注全局调控蛋白CcpA基因编码区内转录因子结合位点—cre2的功能，解析其编码基因与介导转录调控的双重作用。在此基础上，通过鉴定和比较cre2及ccpA基因上游非编码区内的另一个识别位点cre1的特性，阐明它们的作用及协调机制，进而建立新型的、基于双位点的CcpA自调控模型。此外，还将分析并验证CcpA蛋白的“双功能密码子”调控机制在产溶剂梭菌中的普适性，为拓展微生物转录调控的理论知识、优化与遗传改造工业菌株提供线索和策略。

CcpA是革兰氏阳性细菌中的全局性转录调控因子，可直接和间接控制大量复杂的调控网络来影响细胞的生理和代谢功能。虽然CcpA主要通过结合保守的cre位点来调控下游基因的表达，然而CcpA自身表达是通过何种机制调控的呢?这个问题一直没有得到解决。本研究在产溶剂梭菌模式菌-丙酮丁醇梭菌中发现了一种新的CcpA自调控机制。首先，我们通过生物信息学分析和体外凝胶阻滞实验，在ccpA自身基因编码框内鉴定得到一个典型的CcpA结合位点creORF；进一步的研究发现，ccpA上游非编码区还存在一个非典型的CcpA结合位点creP，该creP位点与creORF位点间存在较大差异。随后，通过体内lacZ报告系统检测了CcpA通过creP和creORF两个位点发挥何种调控功能。结果显示，CcpA结合creORF时发挥转录抑制作用，而结合creP时起则起转录激活作用，展示了一种新型的基于双cre位点的CcpA自调控模式。进而，通过对creORF进行同义突变改造，解除了CcpA对自身转录的抑制作用，促进其在细胞内的表达量，从而使菌株的生长、糖利用速率以及溶剂合成能力均得到明显提升，发酵的最高总溶剂产量达到24.48 g/L（丙酮6.55 g/L、乙醇3.36 g/L 和丁醇14.57 g/L），较原始菌株溶剂产量提升了28%。综上，本研究揭示了一种新的CcpA自调控机制并后续工程菌的构建和代谢改造提供了新的指导和借鉴。