海藻溴系FGFR与VEGFR双重抑制剂克服Bevacizumab耐药肿瘤的作用与分子机制研究

FGF/FGFR signaling pathway has been implicated in angiogenesis, cancer, and the escape of tumor vascularization from VEGF inhibitor (bevacizumab) treatment. Combinatorial inhibitors of VEGFR and FGFR are attractive drug candidates against Bevacizumab-resistance cancers. Bromic compound WLJ103 can specially inhibits FGFR1, 3 and VEGFR2 activity. For the purpose of understanding the anti-angiogenesis, anti-refractory cancer effects and their mechanisms of WLJ103, we will study the in vitro and in vivo anti-angiogenesis effects by using the wound healing, tube formation and matrix gel plug methods; study their mechanisms by using the cell transfection, RNAi, and immunoblotting methods on HEK 293 cells and HUVECs which stably expressing or silencing the FGFR1、3 and VEGFR2 proteins; study the therapeutic action on bevacizumab refractory tumor model by utilizing the immunoblotting and immunohistochemical techniques.

FGF/FGFR信号通路在血管生成、癌症发生过程中起重要作用，还可以使肿瘤逃逸于VEGF抑制剂的治疗，联合靶向VEGFR和FGFR已成为治疗贝伐单抗耐药型肿瘤药物研发的重要途径。溴系化合物WLJ103具有特异性抑制FGFR1、3和VEGFR2的作用，是FGFR和VEGFR双信号通路阻断剂。为研究WLJ103的抗肿瘤血管生成作用、作用机制以及对耐药型肿瘤的治疗效果，本项目拟运用创伤修复、微管形成和基质胶塞等方法研究WLJ103体外、体内抗血管生成的作用；以高表达FGFR1，3，VEGFR2的HEK293细胞，沉默的HUVEC细胞为模型，通过细胞转染、RNAi、免疫印迹技术研究化合物对FGFR、VEGFR信号通路中FGFRs、VEGFR、ERK等蛋白表达的变化，揭示化合物的作用机制；建立小鼠肿瘤模型，运用免疫组化等技术研究WLJ103对贝伐单抗耐药型肿瘤的治疗作用。

运用WST-1、Wound-healing、微管形成、鸡胚尿囊膜以及Matrigel plug等试验方法研究了化合物WLJ103体外、体内抗血管生成的作用。发现化合物对HUVECs的生长具有剂量依赖性的抑制作用，其IC50为3.6μg/ml；细胞迁移试验显示，化合物处理48 h后HUVECs的迁移受到明显抑制；毛细管生成试验显示，化合物显著降低了基质胶上形成的内皮管总长度；CAM结果显示，随着浓度的增加，血管生成的数量明显减少；小鼠试验显示，药物处理后血管生成的能力减少；此外，化合物还以剂量依赖性方式降低蛋白激酶B和内皮一氧化氮合酶的磷酸化表达，以及一氧化氮的产生。这些结果表明该化合物可以用作辅助性抗血管生成药物，或用作开发新型多靶RTK抑制剂的先导化合物。通过对57个化合物的抗肿瘤活性筛选，发现多个化合物具有潜在的抗肿瘤细胞增殖的作用，其中化合物CYC23活性最高。对该化合物的抗肿瘤活性验证，发现其对7402肿瘤细胞系效果最好，IC50为10μg/ml；进一步研究发现化合物具有抑制肿瘤细胞集落形成、诱导肿瘤细胞调亡的作用；Western-blotting试验发现化合物对肿瘤细胞调亡信号通路相关蛋白具有调节作用；还可以降低血管内皮细胞一氧化氮的产量，同时抑制血管内皮细胞的血管生成。我们还通过对39个化合物的抗血管内皮细胞增殖活性筛选，发现多个化合物具有潜在的抗血管内皮细胞增殖的作用，其中化合物TSC39活性最高。进一步对化合物TSC39的抗细胞增殖活性验证，发现其对HUVEC细胞选择性最高，IC50为7.0μg/ml，此化合物可能是潜在的血管生成抑制剂。