光棘球海胆性别特异基因Dmrt1和foxl2的表达特性及功能研究

Sea urchin is an economically important mariculture species in China, and the gonads are the solely edible parts for people. Sex differences are thus one of the most contributing factors to the quality of sea urchins. However, little is known about the sex determination and differentiation in sea urchins. In the present studies, our proposal focuses on the studies of testis-specific expression gene Dmrt1 and ovary-specific expression gene foxl2 to learn the sex development of sea urchin. Detailed expression profiling of both genes will be studied in-depth by real-time quantitative PCR (qPCR), in situ hybridization and immunohistochemistry during different stages of gonadal development in Mesocentrotus nudus. Moreover, RNA interference (RNAi) will be utilized to explore their functions and identify the downstream effectors by detecting the expression of marker genes after gene silencing in gonadal cell. Furthermore, the upstream transcriptional regulatory factors will be identified by using protein and DNA interaction technology. This study provides an insight into elucidating the mechanism of the sex determination of sea urchin, and an important theoretical basis for the artificial sex control in sea urchin.

海胆是我国重要的海水养殖种，其性腺组织是海胆唯一可食用部分。性别差异是影响海胆品质的重要因素之一，但海胆性别决定和分化相关的研究还知之甚少。本项目以光棘球海胆精巢特异表达基因Dmrt1和卵巢特异表达基因foxl2为切入点，采用荧光定量PCR、原位杂交和免疫荧光等技术检测两者在光棘球海胆性腺发育过程中的表达特性；结合RNA干扰沉默基因转录实验探讨基因功能，并通过分析基因沉默后各类性腺细胞标记基因的表达情况鉴定下游效应因子；进一步利用蛋白质和DNA互作实验筛选上游转录调控元件。本研究不仅为揭示海胆性别决定和性别分化机制奠定了基础，并且为海胆性别控制育种工作提供了理论依据。

光棘球海胆隶属于棘皮动物门球海胆科，进化地位特殊，是最早出现的后口动物之一。性腺是海胆唯一可食用部分，由于味道鲜美、市场售价高，海胆逐渐成为一种重要的海水经济养殖物种。本研究克隆了一些与光棘球海胆性腺发育相关的基因，包括Dmrt1、foxl2、seali、seawi和boule，并系统解析了其动态表达模式。研究揭示了Dmrt1是光棘球海胆精巢特异表达基因，可以作为雄性生殖细胞的标记基因。Foxl2、boule、seawi在精巢中表达量高于卵巢中的表达量，而seali在卵巢中的表达量高于精巢中的表达量，其中boule、seali、seawi都可作为光棘球海胆生殖细胞标记基因。我们还克隆了Dmrt1和foxl2启动子，并证实Dmrt1启动子ATG上游968bp—1197bp之间和1198bp—1441bp之间分别是Dmrt1的负向和正向调控区域；foxl2启动子ATG上游1759bp—1564bp之间可能是其基因的负向调控区域。本研究在光棘球海胆中建立了基于RNAi的成体水平基因功能研究平台，通过向雄性海胆体腔中注射seawi基因特异的dsRNA，不仅引起精巢中seawi基因表达下调，还影响了其余雄性性别分化通路中保守基因的表达量。此外，我们还在光棘球海胆中开展了简化基因组测序，并进行性别特异分子标记的关联分析，最终鉴定了3个雌性特异的DNA分子标记，建立了一种快速、精准鉴定光棘球海胆遗传性别的技术。有趣的是，多数与性别相关的SNP位点都是雌性杂合、雄性纯和，因此我们预测光棘球海胆的性别决定类型可能为ZW/ZZ型。本研究为实现光棘球海胆性控育种打开新的思路，为解析海胆性别决定和性别分化的机制提供重要支撑。