利用斑马鱼模型和神经细胞系研究kri1l在中枢神经系统发育中的作用

Ribosome is critical in nervous system development and functions. Dysfunction of ribosome biogenesis is associated with types of nervous system diseases. We performed a large-scale forward genetic screen on zebrafish model. We found in cas002 mutants there are some abnormal defects in the central nervous system: the neurons in midbrain were significantly reduced, the midbrain-hindbrain broundary was widen and the hindbrain ventricle was enlarged due to the loss of kri1l protein. These phenotypes were similar to congenital cerebral hypoplasia. The gene kri1l encodes a protein component of the small subunit processome, which produce mature 18S rRNA molecules. The ribosome and protein synthesis are important for the development of central nervous system, however, the specific mechanism remains elusive. This project aims to understand kri1l-mediated regulation on central nervous system development. In zebrafish model using in situ hybridization, immunofluorescence, knock down or overexpression technique, we aim to search the functions of kri1l in midbrain and hindbrain development and its mechanism. Furthermore, we will perform KRI1 conservative function and neuron functions in neuronal cell line using CRISPR/Cas9 knock down technique. We hope this work will be helpful for nervous system diseases with potential clinical applications, especially for congenital cerebral hypoplasia or neonates with cerebral injury.

核糖体在神经系统发育和正常功能中有重要作用，一些编码核糖体蛋白的基因突变会造成神经系统各种疾病。我们利用斑马鱼为模式生物开展了前向遗传学筛选，发现在突变家系cas002中kri1l的失活造成了中枢神经发育的缺陷：中脑神经细胞明显减少，中后脑边界变宽，后脑室增大。该表型类似于人类先天性大脑发育异常的症状。Kri1l是核糖体18S rRNA剪切复合物的重要成员之一，核糖体及蛋白质的合成在神经系统的发育中有重要作用，但其机制尚不明确。本课题的目的是利用斑马鱼模型，采用原位杂交、免疫荧光、敲除/过表达技术等阐明kri1l对中后脑发育的细胞学和生物学功能的影响，在分子水平揭示kri1l调控中后脑发育的机理。在神经元细胞系中，利用CRISPR-Cas9技术敲除KRI1，探索KRI1功能的保守性和神经元功能。希望本研究为神经系统疾病，特别是神经系统先天性发育异常、新生儿出生缺陷，提供理论依据和诊疗思路。

中枢神经系统的发育是其功能实现的重要基础，而其发育的机制和调控网络仍不清晰。我们前期利用斑马鱼为模式生物开展了前向遗传学筛选，发现在突变家系cas002中kri1l的失活造成了中枢神经发育的缺陷：中后脑神经细胞明显减少，中后脑边界变宽，眼睛明显变小，视神经投射区变窄。本项目通过原位杂交、免疫荧光、敲除/过表达技术等技术，阐明kri1l对中后脑发育的细胞学和生物学功能的影响，揭示kri1l调控中后脑发育的机理。项目研究结果表明，kri1l引起的中后脑神经元减少发生在2dpf以后，而早期神经外胚层的诱导和分化并无改变。同时通过kri1l和HuC：EGFP双转基因系的活体实时观察，也证实kri1l引起的中后脑神经元减少开始于2dpf。而免疫荧光显示发现在突变胚胎中神经细胞的增殖明显增多，而细胞凋亡同样明显增多。通过眼睛冰冻切片HE染色和免疫荧光，发现突变胚胎视网膜的发育有缺陷，视网膜各层细胞边界模糊，且各层细胞数目明显减少，视网膜各层细胞宽度变窄。而视锥细胞和穆勒胶质细胞在突变胚胎中明显缺失。视锥细胞的减少，可能造成了突变胚胎对强光敏感，行为学观察同样发现在强光照射下，突变胚胎的活动明显增强。视网膜细胞的增殖明显增多，而细胞凋亡同样明显增多。而rH2AX和p53的免疫荧光染色发现，在突变视网膜细胞中DNA损伤明显增加，导致了细胞周期阻滞在G2/M期，最终引起凋亡。而在中后脑的发育过程中，可能也存在着相同的机制，还需进一步实验验证。综上所述，kri1l引起视网膜的发育缺陷，可能是由于kri1l突变造成DNA损伤积累，导致细胞周期阻滞在G2/M期，引起凋亡。最终导致视网膜各层细胞大量死亡，变窄，视锥细胞和穆勒胶质细胞缺失，引起了突变胚胎的畏光行为。而kri1l引起中后脑发育的异常，也可能有相似的机制。本研究阐明了核糖体相关蛋白kri1l在中枢神经系统发育中的重要作用，为神经系统疾病，特别是中后脑先天性发育缺陷、视网膜发育缺陷，提供实验基础和理论依据。