PARK16位点内SLC41A1基因变异对多巴胺神经元离子稳态和功能的影响

Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease. Although it is generally accepted that the disease is caused by both genetic and enviromental factors, its exact pathogenesis remains unclear. To date, researchers have identified 18 loci, of which genes for PARK3, PARK10, PARK12 and PARK16 have not be cloned yet. The PARK16 locus contains four genes of NUCKS1，RAB7L1，SLC41A1and PM20D1. SLC41A1 protein is a relatively universal ion channel, and ions like magnesium, copper, zinc, iron are associated with the pathogenesis of PD. To further explore the role of PARK16 locus in PD, we previously identified three new variants (p. Lys146Glu, p. Pro480Pro and a new intron variant) in SLC41A1 gene after screening Chinese PD patients for mutations in PD-associated genes. Whether the unusual expression of SLC41A1 gene and its variants break the cellular ionic homeostasis? Whether it's the way by which the gene affects the survival of neuron? And the inherent mechanism remains to be studied.

帕金森病(parkinson's disease, PD)是第二大神经变性疾病，为一遗传因素和环境因素共同起作用的复杂疾病，其致病机制尚未阐明。目前已定位了18个帕金森病遗传位点，其中PARK3、PARK10、PARK12和PARK16位点的致病基因尚未克隆。PARK16位点包括NUCKS1，RAB7L1，SLC41A1和PM20D1四个基因，其中SLC41A1基因表达的蛋白是一相对较广谱的离子通道，而金属离子铁、镁等被报道与PD发病相关。为了更深入地研究PARK16位点与PD发病的相关性，我们的前期工作对其相关基因在PD患者中行突变检测，发现了3个SLC41A1基因的新变异(p. Lys146Glu, p. Pro480Pro和一个内含子区域的变异)。因此，我们拟在细胞和动物模型中研究SLC41A1基因及其变异是否通过影响金属离子稳态而影响神经元的存活，及其作用机制。

本项目经3年实验，对项目的完成情况概述如下：（1）我们首先构建了SLC41A1野生型和突变体的载体，过表达后其细胞定位图示其主要分布于细胞膜，部分定位于细胞浆，且部分呈点状聚集，western图也显示部分分布于堆积胶中，且野生型和突变体间无明显区别；（2）自噬或线粒体自噬异常为PD发生的病理机制之一，SLC41A1既然作为PARK16相关基因，检测了其对自噬或线粒体自噬的影响，结果示：过表达SLC41A1野生型及突变体蛋白的细胞中LC3-II（自噬标志蛋白）及TIM23（线粒体内膜蛋白）均无明显改变，提示该蛋白可能并不参与线粒体自噬过程。另外，α-synuclein的异常聚集导致PD的发生，而自噬的异常可以导致α-synuclein的聚集。因此，我们还检测了SLC41A1过表达对α-synuclein的表达水平的影响，但并未检测到α-synuclein蛋白表达水平的改变。 （3）为明确SLC41A1过表达对细胞凋亡的影响，我们通过MTT实验和流式细胞术进行检测。结果显示，过表达SLC41A1会影响细胞增殖，尤其是过表达SLC41A1突变体蛋白时，细胞活性明显受抑制。（4）SLC41A1为细胞膜上金属离子的转运体，主要参与对Mg2+的转运（从胞内转运至胞外），因此我们检测SLC41A1突变体对该功能的影响。结果示：过表达SLC41A1 WT促进低镁环境下细胞内Mg2+的外流，而SLC41A1突变体则使SLC41A1转运Mg2+的功能缺失。（5）我们运用CRISPR技术构建了SLC41A1敲除的细胞株。结果示：敲除SLC41A1增加MPP+处理引起的细胞死亡。敲除SLC41A1使SLC41A1转运Mg2+的功能缺失。（6）截止2015.06.01已完成295例PD病例和340例病例对照组的收集，对上述病人进行SLC41A1和RAB7L1进行了基因检测，SLC41A1基因上只发现1内含子变异(c.552 + 50G > A)， RAB7L1上未发现突变或变异。（7）构建了SLC41A1相关的过表达和干扰的病毒包装载体，为进一步的动物实验奠定基础。（8）SLC41A1基因突变的PD病人体液中的离子浓度与正常人之间无统计学意义。.综上，项目经三年实施，基本完成了既定实验内容。在本项目资助下发表SCI.论文1篇，相关论文已投plos one杂志，处于审稿中，部数据正在整理