利用诱导敲除小鼠模型结合蛋白质组学技术系统识别APC/C的底物和功能相关蛋白及其功能分析

细胞周期末期促进复合物(Anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C)是由十几个亚单位组成的大型的E3泛素连接酶，在细胞周期调控中发挥关键作用，最近越来越多的研究证明APC/C在分化成熟的细胞中参与有丝分裂后(post-mitotic)功能。本课题组将利用已经建立的干扰素诱导敲除Apc2基因的小鼠模型结合差异凝胶电泳（DIGE）/液相色谱（LC）和高分辨率高精确度的LTQ Orbitrap串联质谱等蛋白质组学技术及抗体芯片技术研究Apc2基因敲除导致APC/C功能失活后小鼠肝脏、脾脏、胸腺、骨髓等组织及血清中蛋白表达谱变化，系统识别相关组织中APC/C的底物及功能相关蛋白，探索APC/C的新底物及功能相关蛋白继而发掘APC/C的新功能尤其是在肿瘤发生与形成中的作用。这对于深入研究APC/C的生物功能及肿瘤发生的分子机制具有重要理论创新意义。

APC/C是细胞内最大的E3泛素连接酶复合体，APC2蛋白是它的核心组份。APC/C复合体的主要功能是调控细胞有丝分裂的有序进行，APC/C复合物及APC2蛋白在造血系统的作用未见报道。通过构建髓细胞特异性敲除Apc2基因的Apc2flox/floxLyzM-Cre小鼠我们发现，尽管Apc2基因髓细胞特异性敲除小鼠与对照组小鼠表型无差别，却可以抵抗自发肿瘤、排斥移植肿瘤、抑制AOM-DSS诱导的肠道肿瘤发生。由于肿瘤发生中的巨噬细胞异常极化发挥重要作用并且Apc2基因髓细胞特异性敲除后巨噬细胞表现促进M1型极化和抑制M2型极化的现象。髓细胞特异性敲除Apc2基因可能通过影响巨噬细胞的极化影响肿瘤的发生。通过构建Apc2flox/floxMx1-Cre小鼠我们发现Apc2基因诱导敲除时小鼠的肝、脾、胸腺、骨髓等多个脏器出现严重损伤。Apc2flox/floxMx1-Cre/WT骨髓移植嵌合体小鼠在诱导敲除Apc2基因后产生类似再生障碍性贫血的表型，即骨髓中静止期造血干细胞几乎完全消失，干祖细胞数量下降且增殖功能缺陷，外周血细胞数量显著降低。原位检测再障患者和正常人群骨髓标本中APC2表达情况发现在正常人CD34阳性造血干细胞中APC2呈高表达，而在绝大多数再障患者造血干细胞中APC2无表达。APC2表达缺失可能是再障病人的致病原因。通过TCGA数据分析我们发现KLF5在肾透明细胞癌病人中表达明显下调，且随着病程恶化KLF5表达降低，KLF5的高表达与病人的生存期正相关，提示KLF5在肾癌中可能发挥抑癌基因作用。肾癌中KLF5的低表达与其DNA的高度甲基化相关。通过体内及体外试验进一步明确KLF5表达可能通过转录抑制HIF-2α表达抑制肾癌细胞的生长及转移。KLF5还可以抑制肝细胞癌生长及转移，提示KLF5抑癌基因的作用具有普遍性。我们还发现在肝癌中转录因子Slug与细胞迁移能力无关，抑制Slug表达却可以增强肝癌细胞成球生长和软琼脂克隆形成等锚定非依赖增殖能力并增加肿瘤干细胞相关基因表达。抑制Slug表达可以增强细胞对Hoechst染料的泵出能力并增强肝癌细胞对多种化疗药物的抵抗。抑制Slug表达可以在转录水平增加ABC蛋白泵家族多个蛋白的表达并且用抑制剂抑制ABC蛋白泵的活性后肝癌细胞恢复了对多种化疗药物的敏感性。以上发现为再障及肿瘤发生的机制研究提供了新线索。