miR-424对子宫内膜癌生长的作用机制研究

microRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression and involved in diverse biological processes. Our previous study found that miR-424 was downregulated in the endometrial cancer tissues, and miR-424 overexpression resulted in the inhibition of cell colony number, the G1/S arrest, and promoted cell apoptosis. The 3'UTR of the transcription factors, E2F6 and E2F7, had binding sites of miR-424, and miR-424 suppressed the expression of E2F6 and E2F7 mRNA. On the basis of these results, we will validate whether E2F6 and E2F7 are direct targets of miR-424, and investigate the roles of the targets in cell growth. We will also explore whether E2F6 regulates miR-424 expression through binding to its promoter. Finally, we will perform cDNA microarray for screening other targets of miR-424 besides E2F6 and E2F7. All these will reveal the regulatory mechanism of miR-424 in endometrial cancer cell growth, and provide beneficial strategy for the exploration of the rapeutic targets for endometrial cancer.

微小RNA（microRNA，miRNA）作为基因表达的转录后调控因子，广泛参与一系列的生物学过程。本课题组前期研究发现miR-424在子宫内膜癌组织中表达下调，过表达miR-424导致细胞克隆数降低、细胞周期G1/S进程受阻，细胞凋亡增加。利用生物信息学初步发现转录因子E2F6和E2F7的3'UTR具有miR-424的结合位点，并且miR-424抑制E2F6和E2F7的mRNA水平。在此项目基础上我们将对miR-424的候选靶基因E2F6和E2F7进行验证，并深入研究它们在细胞生物学功能方面如何介导miR-424发挥作用以及E2F6如何通过作用于miR-424的启动子而调控miR-424的表达。此外，我们还将利用cDNA芯片筛选E2F6和E2F7以外的其它靶基因。研究这些为阐明miR-424在子宫内膜癌中的作用机制奠定基础，为发现更多的肿瘤治疗靶标提供策略。

本项目在前期发现miR-424在子宫内膜癌组织中低表达的基础上，旨在进一步探讨miR-424对子宫内膜癌细胞恶性表型的影响，包括细胞活性、细胞增殖、细胞迁移及侵袭能力。并通过生物信息学分析筛选miR-424的靶基因，而后利用GFP融合报告载体技术结合实时定量PCR及Western blot方法进一步验证miR-424对其靶基因的调控方式，并利用细胞表型实验确定靶基因对细胞恶性表型的影响，以阐明miR-424作用于子宫内膜癌的分子机制。在此基础上，寻找miR-424上游调控方式，建立反馈调控网络。. 通过研究我们证实与癌旁组织相比，miR-424在子宫内膜癌组织中的表达水平明显降低，且在高分级瘤组织中的表达水平与低分级组织相比也明显增高。细胞表型实验结果显示，miR-424在体外可抑制子宫内膜癌细胞的细胞活性、增殖、迁移及侵袭能力。荷瘤鼠模型体内实验证实miR-424在体内可抑制子宫内膜癌的增殖。通过生物信息学分析结合实时定量PCR及Western blot方法，最终确立E2F6为miR-424的靶基因。接下来通过RNA干扰技术证实敲降E2F6的表达同样可增强子宫内膜癌的细胞活性、增殖、迁移及侵袭能力。挽救实验结果显示过表达E2F6可抵消miR-424对子宫内膜癌细胞恶性表型的影响,进一步证实E2F6是miR-424的直接作用靶基因。最后，通过检测miR-424及E2F6的表达水平变化时上皮及间皮细胞表型的分子标志物的蛋白水平变化证明EMT参与了miR-424及E2F6对子宫内膜癌细胞迁移及侵袭的调控过程。同时，我们证实了E2F6可以影响miR-424的表达，从而形成一种反馈调节机制。这种调控轴形成一种调控网络而影响子宫内膜癌细胞的增殖能力、侵袭能力和迁移能力。. 本研究确立了miR-424对子宫内膜癌发生发展的影响及其分子机制，为理解子宫内膜癌的发生和开发子宫内膜癌早期诊断试剂及有效治疗药物提供实验线索和理论依据。