基于微型DNA条形码的木材识别基础研究

In this proposal, to solve the problem that is difficult or impossible to identify timbers on a species level using the wood anatomy method, the DNA mini-barcode technology is developed for providing effective information with high resolution. The effective extraction of wood DNA and determination of the suitable DNA mini-barcode for wood identification are the key for the application of the method. Methods of laser confocal scanning microscope (CLSM), ultraviolet spectrophotometry, real-time fluorescent quantitative PCR, and nested PCR are applied to clarify the regularity between the quantity and distribution of DNA in wood cell, verify the influence of wood extractives for the quality of DNA from wood and the success rate of PCR amplification, and establish the wood DNA extraction method. The genetic distance analysis, barcoding gap test and wilcoxon non-parametric test are applied to illuminate the relationship between DNA mini-barcode and the species authentication capability, and determine the type and fragment length of DNA mini-barcode suitable for wood identification. Furthermore, the aim of the study for identifying wood on the species level is achieved based on selected the DNA mini-barcode. The results of the fundamental work could promote the development of wood identification method, and also lay the scientific foundation for the conservation and sustainable use of the global wood resources.

本项目拟开展基于微型DNA条形码（DNA mini-barcode）的木材识别基础研究，为解决传统木材解剖学方法无法在“种”水平上识别木材这一科学难题提供重要依据。木材细胞DNA的有效提取和微型DNA条形码的科学确定是本研究的关键基础。通过采用激光共聚焦显微分析、紫外分光光度分析、荧光定量PCR及巢式PCR在内的多种方法，揭示木材细胞中DNA的含量与分布规律，探明木材抽提物对DNA提取质量和扩增成功率的影响，建立木材DNA有效提取方法。同时，利用遗传距离、条形码间隔及Wilcoxon非参数检验分析方法，构建微型DNA条形码类型及长度与木材物种识别成功率的关系，确定适用于木材识别的微型DNA条形码，以实现木材“种”的准确识别。研究成果将为木材识别提供新途径，为保护与可持续利用全球木材资源奠定科学基础。

本项目开展了基于DNA条形码的木材识别基础研究，利用包括激光共聚焦显微分析、紫外分光光度分析、数字微滴PCR在内的多种方法，揭示木材细胞中DNA的含量与分布规律；采用遗传距离、条形码间隔及系统进化树分析方法，建立DNA条形码类型及长度与木材树种识别成功率的关系，创新构建了木材DNA条形码识别方法体系，解决了传统木材解剖方法无法在“种”水平识别木材的科学难题，为濒危树种多样性保护和林产品贸易健康发展奠定了重要基础。.建立了木材DNA高效提取方法。组织化学分析表明木材DNA主要存在于木材射线及轴向薄壁细胞，为木材DNA靶向提取奠定了基础。针对样本用量、样本裂解时间和木材DNA沉淀时间等DNA提取方法中的3个关键指标进行梯度优化实验。研究表明，在DNA裂解液体积与样本量比值一定的条件下，300mg是最优的木材样本用量，与优化前相比样本量减少40％；5小时和0小时分别是最佳的样本裂解时间和DNA沉淀时间，与优化前相比DNA提取周期缩短58％。.优选确定了适用于木材识别的DNA条形码。DNA条形码类型和片段长度是影响条形码识别能力和获取成功率的重要因素。条形码片段长度越短，获取成功率越高，但识别能力会随之降低。确定了适用于黄檀属（Dalbergia）、紫檀属（Pterocarpus）、檀香属（Santalum）木材树种识别的组合DNA条形码类型，分别为ITS2+psbA-trnH、matK+ndhF-rpl32+ITS2和psbA-trnH+trnK；确定了微型DNA条形码ndhF-rpl32可应用于构造特征极为近似的2种紫檀属木材檀香紫檀（P. santalinus）和染料紫檀（P. tinctorius）物种识别；基于叶绿体全基因组水平筛选并推荐ycf1作为紫檀属木材识别的高分辨DNA条形码。.构建了濒危珍贵木材DNA条形码数据库。依托木材标本馆凭证标本，构建了30余种濒危珍贵木材DNA条形码数据库，证明了应用馆藏标本构建DNA数据库的可行性。为木材DNA识别技术应用提供了基础数据资源。.综上，本研究建立了木材DNA有效提取方法，为木材DNA条形码识别实际应用奠定了基础；形成了木材DNA提取、DNA条形码优选、条形码数据库构建的木材DNA识别方法体系，为森林树种多样性保护和木制品产业链监管提供重要支撑。