基于小胶质细胞活化与NO-cGMP-PKG信号通路关联的四逆散治疗功能性消化不良的机制探索

Functional dyspepsia is one of the TCM advantageous diseases. Sini San has a good curative effect in the treatment of FD, however, the definite therapeutic mechanism remains unclear. Researche showed that the activation of microglia in the dorsal horn of the spinal cord and the expression of central and peripheral NO-cGMP-PKG signaling pathway were closely related to visceral hyperalgesia and gastrointestinal motility disorders. The present item put forward the hypothesis that Sini San plays a role in the regulation of microglia activation and the NO-cGMP-PKG pathway to improve visceral sensitivity and gastrointestinal motility of FD rats.There'll be four parts in this study:1. To investigate the effects of Sini San on visceral sensitivity and gastrointestinal motility in FD rats, and to investigate the effects of Sini San on the activation of microglia and the expression of iNOS, cGMP and PKG in the dorsal horn of spinal cord in FD rats in vivo. 2. To explore the effect of Sini San on the pathway of microglia activation-iNOS-NO-cGMP-PKG by cell experiments. 3. To explore the effects of Sini San on contraction and relaxation of isolated rat gastric smooth muscle strips in vitro tissue experiment, and explore the effect of L-NAME on Sini San action. 4. To explore the material basis of the effect of Sini San on the basis of the above experiments.

功能性消化不良(FD)是中医药治疗的优势病种，四逆散治疗FD具有良好的疗效，但作用机制尚不明确。研究表明：脊髓背角小胶质细胞活化及中枢和外周NO-cGMP-PKG信号通路表达与内脏痛觉过敏及胃肠动力障碍关系密切。本项目提出假说：“四逆散可有效改善FD大鼠内脏敏感性及胃肠动力，其作用机制与抑制脊髓背角小胶质细胞活化，调节中枢及外周NO-cGMP-PKG信号通路表达相关。”研究内容：1.探讨四逆散对FD大鼠内脏敏感性及胃肠动力的调节作用，并探索其对FD大鼠脊髓背角小胶质细胞活化及iNOS、cGMP、PKG表达的影响；2.探索四逆散对小胶质细胞活化-iNOS-NO-cGMP-PKG整条通路的调节作用；3.通过离体组织灌流实验，探索四逆散对大鼠离体胃平滑肌条收缩/舒张运动的影响，并探索NOS抑制剂L-NAME对四逆散药效的影响；4.在完成以上实验的基础上，初步探索四逆散起效的物质基础。

研究背景：功能性消化不良(FD)是中医优势病种，四逆散(SNS)治疗FD具有良好疗效，但机制不明。.研究内容：1、动物在体实验中，采用幼年期碘乙酰胺（IA）灌胃联合成年后夹尾应激建立FD大鼠模型。SNS治疗后，检测FD大鼠体重、3h进食量、胃排空率、小肠推进率及其对不同压力胃扩张刺激的行为学评分和肌电图变化，综合评价SNS对其内脏敏感性及胃肠动力的影响。用免疫荧光法检测iNOS及Iba1阳性细胞在大鼠脊髓背角的分布，Real-Time PCR和Westernblot法分别检测c-fos、iNOS、GABAb的基因表达和iNOS、GABAb的蛋白水平。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定脊髓背角cGMP和PKG蛋白含量。2、细胞实验中，以LPS诱导小胶质细胞活化，用不同浓度的SNS培养基、芍药苷培养基、枳实总黄酮苷培养基以及甘草酸培养基分别培养细胞24h，摸索药物无毒浓度并建立细胞模型，采用免疫荧光检测其Iba1表达情况，采用Westernblot检测Iba1及iNOS蛋白水平，采用Real-Time PCR检测其iNOS基因相对表达量，采用ELISA检测cGMP和PKG蛋白含量，采用细胞流式检测探索NO释放量。3、离体组织灌流实验中，分别探索不同浓度的四逆散、柴胡皂苷、枳实总黄酮苷对大鼠离体胃平滑肌条收缩/舒张运动的影响。.研究结果：1、SNS显著降低了分级胃扩张刺激下FD大鼠的行为学评分和对应的肌电图反应，显著减少FD大鼠脊髓背角Iba1及iNOS阳性细胞的分布，调节脊髓背角c-fos、iNOS、GABAb基因表达及iNOS、GABAb、cGMP、PKG蛋白表达。2、甘草酸可有效抑制小胶质细胞向活化形态的转变，降低其Iba1的荧光强度及蛋白表达，降低其iNOS的基因及蛋白表达，调节NO-cGMP-PKG信号通路及NO的释放。3、SNS可改善FD大鼠小肠推进率，但SNS及枳实总黄酮苷对大鼠胃体离体平滑肌条收缩-舒张运动未产生明显的调节作用，高浓度柴胡皂苷对肌条收缩具有一定的抑制作用，但结果受其在浴槽中产生的大量泡沫样物质影响。.研究结论：SNS可调节FD大鼠脊髓背角小胶质细胞的活化及NO-cGMP-PKG信号通路的表达，改善其内脏敏感性及胃肠动力。.科学意义：本研究为中医药治疗FD的基础研究提供了一定的研究思路，为SNS治疗FD的临床推广提供了一定的实验依据。