猪流行性腹泻病毒nsp13拮抗IFN-β产生的分子机制研究

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), a pathogenic enteric coronavirus, infects suckling piglets and causes diseases characterized by vomiting, watery diarrhea and dehydration and high mortality, resulting in huge economic losses to swine industry. PEDV nsp13, a RNA helicase, is the key component for viral genome replication and gene transcription. Our previous data demonstrated that: (1) nsp13 antagonized IFN-β production; (2) nsp13 nucleus distribution might contribute to IFN-β antagonizing. Accordingly, the proposed project aims to elucidate mechanisms of nsp13 blocking IFN-β production, including: (1) characterize the specific target(s) of nsp13 tap; (2) verify the functional domain(s) or amino acid(s) of nsp13 responsible for IFN-β antagonizing activity; and (3) clarify whether the nucleus retention is significantly contributed to IFN-β blockade activity. By utilizing the constructed full-length infectious clone of highly virulent PEDV and the reverse genetics platform, we plan to generate recombinant viruses with truncations or mutations in nsp13 to pinpoint the key motif(s) responsible for immune-regulation function of nsp13 in PEDV infected cells. The expected findings will improve our understanding of the pathogenesis and immunogenicity of PEDV.

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种肠道冠状病毒，引起新生仔猪的腹泻、脱水、死亡，对养猪业构成巨大威胁。PEDV非结构蛋白nsp13为病毒的解旋酶，在病毒转录复制中发挥重要作用。我们的前期研究意外地发现nsp13除了具有解旋酶活性外，还具有拮抗IFN-β产生的特性，且nsp13拮抗IFN-β的活性与其亚细胞定位密切相关。本项目拟在前期研究的基础上，进一步解析nsp13拮抗IFN-β产生的关键靶点，确定nsp13拮抗IFN-β产生的关键结构域或氨基酸位点，揭示nsp13的亚细胞定位与其拮抗IFN-β产生的关系；借助本课题组建立的PEDV反向遗传操作系统，构建nsp13关键结构域或氨基酸位点缺失/突变的重组病毒，比较分析nsp13缺失/突变毒株和野生型毒株对IFN-β产生的影响，深入揭示PEDV nsp13拮抗IFN-β产生的分子机制，为阐明PEDV的致病与免疫机理奠定理论基础。

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）是一种再现的α冠状病毒，能够导致仔猪严重腹泻，发病率和死亡率可高达100%。病毒为有效建立感染，其中策略之一便是通过病毒编码的蛋白抑制IFN及其信号通路，以达到逃逸天然免疫的目的。冠状病毒nsp13是一种解旋酶，能够解旋病毒RNA，在病毒复制中发挥重要作用。前期通过双荧光素酶筛选发现nsp13是最有效抑制仙台病毒（Sendai virus, SEV）诱导的IFN-β启动子活性。但PEDV nsp13拮抗天然免疫的分子机制及其生化特征却不清楚。本项目将从1. nsp13抑制IFN-β产生的分子机制；2. nsp13体外功能探究；3. nsp13抑制IFN信号通路的分子机制等方面探究PEDV nsp13功能。结果发现nsp13能够抑制IFN-β 产生，抑制IRF3/IRF3-5D及其上游信号分子诱导的IFN-β 启动子活性，抑制IRF3磷酸化修饰和核转运过程。IRF3在SEV感染后能够发生磷酸化修饰。在SEV感染的细胞中，nsp13能够与IRF3发生相互作用；而非SEV感染的细胞中，nsp13不能与非活化的IRF3发生相互作用，揭示nsp13靶向活化的IRF3，并降解活化的IRF3，从而抑制IRF3入核。且点突变试验发现K289、D375、E376、Q404、R444和R568是nsp13发挥抑制IFN-β产生的关键位点。体外功能探究发现，与其他冠状病毒类似，PEDV nsp13同样具有ATPase和解旋酶活性，并且依赖金属离子Mg2+和Mn2+。核酸结合实验发现nsp13能够结合并解旋dsDNA和dsRNA，且解旋方向为5’-3’，解旋功能同样依赖于Mg2+和Mn2+。nsp13发挥解旋酶活性需要能量，它能够利用核糖核酸或者脱氧核糖核酸作为能量，偏好利用ATP作为能量来源，解旋酶酶活性适宜pH值为6-9。点突变试验发现K289、D375、E376、Q404、R444和R568氨基酸位点同样对ATPase活性至关重要。说明ATPase对nsp13发挥抑制IFN-β至关重要。另外，nsp13能够抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活性及ISGs基因表达。nsp13能够抑制ISGF3入核，抑制JAK1、TYK2、STAT1、STAT2磷酸化修饰。nsp13能够与干扰素受体IFNAR1