TNF-α介导缓激肽开放血肿瘤屏障的效果及其机制探讨

我们前期研究工作发现，TNF-α可能介导了血肿瘤屏障(BTB)的开放，但TNF-α对BTB作用的确切机制尚有待探讨。为明确TNF-α是否可作为选择性开放BTB的新靶点，我们首先观察TNF-α对肿瘤坏死因子受体封闭的BTB和紧密连接蛋白基因沉默的BTB的影响，确定TNF-α发挥作用的受体和作用部位。再通过检测高表达TNF-α的人脑微血管内皮细胞内MAPK和NF-κB的表达情况，确定TNF-α的作用途径。其后，通过凝胶阻滞试验探讨NF-κB与occludin启动子基因的结合情况，揭示TNF-α开放BTB的机制。最后，研究联合应用rhTNF和环磷酰胺对胶质瘤动物BTB和生存时间的影响，并在此基础上研究人脑胶质瘤组织中TNFR表达水平的差异，为将TNF-α介导缓激肽选择性开放BTB的途径应用于脑肿瘤的临床治疗提供实验依据。

本项目首先观察了TNF-α对封闭了肿瘤坏死因子受体的血脑屏障和血肿瘤屏障的影响，确定了TNF-α是通过TNFR1受体来发挥作用的。又进一步建立了高表达TNF-α的人脑微血管内皮细胞(HBMEC)模型，结果发现TNF-α高表达的HBMEC细胞内MAPK及NF-κB表达水平均较对照组明显升高，提示TNF-α开放血肿瘤屏障的作用与MAPK和NF-κB的表达关系密切，即TNF-α开放血肿瘤屏障的作用可能是通过MAPK和NF-κB来介导的。在此基础上又观察了TNF-α对occludin基因沉默的HBMEC构建的血脑屏障和血肿瘤屏障的影响，结果发现，occludin基因沉默的脑微血管内皮细胞构建的体外血肿瘤屏障，其内皮细胞上TNFR1/TNFR2的转录和翻译水平均较高；此时检测血肿瘤屏障的紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达发现，紧密连接蛋白ZO-1的表达较对照组降低，而occludin无表达，提示TNF-α主要是通过作用于血肿瘤屏障的occludin蛋白来发挥作用的。最后，我们检测了NF-κB蛋白与occludin启动子的结合情况，发现NF-κB是通过作用于occludin启动子基因来发挥作用的。通过上述研究我们推测，TNF-α介导缓激肽选择性开放血肿瘤屏障的作用是通过与TNFR1结合引起了MAPK和NF-κB的活化，活化的NF-κB进入内皮细胞内与occludin基因启动子结合引起occludin蛋白表达减少而开放血肿瘤屏障的。我们又在此基础上，研究了联合应用重组人肿瘤坏死因子（recombinant human tumor necrosis factor-α, rhTNF）和环磷酰胺对胶质瘤动物生存时间的影响及人脑胶质瘤组织中TNFR表达水平的差异，结果发现，与单独应用rhTNF和环磷酰胺的大鼠相比，联合应用rhTNF+环磷酰胺的大鼠胶质瘤细胞和胶质瘤血管内皮细胞中rhTNF结合 TNFR的水平及内化数量明显增加，且此时大鼠的生存期明显延长。而Ⅳ型人脑胶质瘤组织中的TNFR1表达量最多。提示rhTNF促进环磷酰胺通过血肿瘤屏障的作用可能是通过与TNFR1结合，进而通过TNFR1的内化作用将环磷酰胺一并转运到内皮细胞内来发挥作用的。因此，本研究不仅可以在理论上阐明TNF-α开放血肿瘤屏障的机制，还可以为临床制定脑肿瘤治疗方案提供新思路。