水芹总酚酸抗乙肝病毒作用机制研究

经对水芹20年的系统、深入研究，从中发现水芹总酚酸具有很强的抗乙肝病毒（HBV）作用，不仅能清除血液中的HBV,还能清除肝细胞内的HBV，具有反跳轻，安全性好的特点，但其抗HBV的作用靶点和分子学机制尚不完全清楚。拟应用药理学、病毒学和分子生物学实验技术，从抑制病毒复制环节研究水芹总酚酸的抗HBV机制。以体内外实验相结合，以HBV基因转染的2.2.15细胞细胞和HBV-杆状病毒-HepG2细胞模型；DHBV感染雏鸭模型；HBV转基因小鼠模型为基础，研究水芹总酚酸抗HBV的作用靶点和机制，特别要探明其对DNA聚合酶、cccDNA清除能力的分子生物学基础。

水芹总酚酸（Oenanthe Javanica Total Phenolic Acid，OJTPA）是水芹全草的提取物，本课题应用药理学、病毒学和分子生物学实验技术，从抑制病毒复制环节研究OJTPA的抗乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）作用靶点和机制，探明了其对DNA聚合酶、cccDNA清除能力的分子生物学基础。①以2.2.15细胞为研究对象，确定OJTPA对细胞的最大无毒浓度为500 μg/mL，药物稀释成500、250、125 μg/mL后加入2.2.15细胞进行培养，每4 d换同浓度药物培养液；分别收集第4、8天以及停药后4 d的培养液，酶联免疫法（ELISA）测定HBsAg和HBeAg含量。结果发现OJTPA在最大无毒浓度时（500 μg/mL），对HBsAg和H BeAg 具有明显的抑制作用，第8天时的抑制率分别为59.33%和90%，半数抑制浓度（IC50）分别为484.17和379.89 μg/mL，治疗指数（TI）分别为3.158和4.025，结果表明水芹总酚酸对2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg 有显著的抑制作用。②以2.2.15细胞为研究对象，研究OJTPA对HBV-DNA、cccDNA的抑制作用。结果发现在细胞培养的第8天，OJTPA高、中剂量（500、250 μg/mL）的抑制作用达到最大，HBV-DNA为62.3%和47.7%，cccDNA为62.7%和61. 3%，且在停药后4 d 仍保持较高的抑制率（P < 0. 05）。表明OJTPA可以有效的抑制2.2.15细胞HBV-DNA和cccDNA的表达，抗病毒作用明显，且无明显的停药反跳现象。③取造模成功雏鸭随机分成模型组、拉米夫定（50 mg/kg/d）阳性药对照组、OJTPA （125、250、500 mg/kg/ d）治疗组。分别留取感染第7天（0 d）、给药5 d、给药10 d及停药3 d的血清，斑点杂交、放射自显影测定血清中DHBV-DNA的OD值进行自身和组间比较，另取肝组织适量镜下观察肝组织病理变化。结果发现OJTPA用药组在5 d、10 d和停药3 d均对DHBV-DNA 具有明显的抑制作用，病理观察发现OJTPA具有较强的肝细胞保护作用。