磁性纳米粒子增强自噬小体DC疫苗抗肿瘤及机制研究

Biotherapy for cancer has been great concerned by the clinicians. Dendritic cells (DCs) vaccine loaded with the tumor antigen and then transfused into patients with cancer is one of the most potential strategies, which has the advantages of high efficiency, low toxicity, low side effects and so on. During DCs loaded, the types and the amount of tumor antigens are extremely crucial and directly affect the strength of immune responses. Our previous studies showed that autophagosome (autophagy tumor antigen vaccine) was a novel and efficient kind of tumor vaccine, had good immunogenicity, could stimulate effectively anti-tumor immunity, compared with tumor lysates, and could up-regulate the expression of CD40 on the surface of DCs. Meanwhile, we found the phonemenon that magnetic nanoparticles could stimulate the expression of CD40 on DCs and could be regarded as immune adjuvant. Due of the mechanism and function of CD40 activating T cells in anti-tumor immune response not clear, the immune effects and mechanisms induced by autophagosome-DCs vaccine and magnetic nanoparticles will be explored. Following the studies, the experimental basis for the clinical application of autophagosome and magnetic nanoparticles will be provided, and the theoretical basis of biotherapy based on the expression of CD40 on the surface of DCs will be clarified.

以肿瘤抗原负载树突状细胞（DC）回输恶性肿瘤患者体内为代表的肿瘤生物治疗作为一种新型肿瘤治疗模式具有高效、低细胞毒性和低副作用等特点已广受关注。抗原的类型和多寡在负载DC时极为关键，直接影响免疫应答的强度。我们利用肿瘤细胞自噬过程中蛋白质降解途径所产生的富含各种代谢蛋白的纳米级颗粒"自噬小体"作为抗原疫苗，发现其能有效启动免疫反应，促进DC表面共刺激分子CD40表达。同时，我们利用合成的超顺磁氧化铁纳米粒子能够促进DC表达CD40的现象使其作为佐剂，辅助自噬小体的抗肿瘤作用。鉴于CD40在肿瘤免疫应答中诱导功能性T细胞的机制尚不清楚，我们将利用与"自噬小体"同源的CD40敲除小鼠，研究CD40在自噬小体抗肿瘤过程中与功能性T细胞的作用与机制，为该疫苗和氧化铁纳米粒子的临床应用提供实验依据，为临床生物治疗中检测DC表达CD40提供理论基础并为提高DC表面CD40表达为基础的基因治疗奠定基础。

肿瘤免疫治疗是新型的抗肿瘤治疗手段，其目的是激发和增强机体自身免疫能力来治疗肿瘤。树突状细胞（Dendritic cell, DCs）是机体内抗原递呈能力最强的专职抗原提呈细胞。抗肿瘤DCs疫苗启动抗肿瘤免疫的有效性依赖于负载的抗原形式。本研究采用MMSN负载OVA模式抗原后，验证其MMSN的免疫佐剂功能。然后通过自噬诱导剂、蛋白酶体抑制剂、溶酶体抑制剂处理肿瘤细胞，诱导分离出特异性的自噬性抗原DRibble，验证MMSN-DRibble的免疫原性，检测DC负载佐剂后的功能标志变化，及活化特异性T细胞的能力。.本研究从以下方面进行：. 1、通过材料学检测，检测MMSN的性能特点，包括MMSN的透射、扫描电镜，粒径分布获得材料的形态大小，通过红外光谱和X-线衍射证明材料的表面基团修饰。氮气吸脱附实验证明MMSN的介孔吸附能力。磁性测试得到材料的磁滞回线。并检测MMSN吸附纯化模式抗原OVA的能力。. 2、体外观察DC吞噬MMSN-OVA。MMSN-OVA对DC的凋亡没有显著影响。其能显著上调DC表面CD40、CD80、CD86和MHC-II的表达。相比与单独的OVA，可以更好地刺激体内的特异性T细胞活化，分化成CD3+CD8+IFN-γ+ T 细胞杀伤肿瘤。. 3. 小鼠肿瘤细胞SCC7经自噬诱导剂、抑制蛋白酶体和溶酶体抑制剂处理24小时后，收集获得的自噬小体，表达自噬标志分子LC3-II和Ub。电镜显示DRibbles富含大量自噬体结构，直径约200-500nm不等。具有较强刺激淋巴细胞增殖作用作用。与肿瘤细胞裂解物相比，DRibble-DCs在体外具有更强的刺激淋巴结来源T细胞和脾脏来源T细胞增殖的能力，并且DRibble浓度升高，活化DC抗原提呈的功能受到抑制可能是与DC的ERS通路激活有关。MMSN结合DRibble后负载DC作为新型DC疫苗，在体内实验显著提高荷瘤小鼠生存率。. 本研究明确了新型MMSN纳米材料的特性及其在DC疫苗作为佐剂的应用。诱导分离口腔鳞癌细胞系来源DRibble并在体外证实其对淋巴细胞增殖活化的作用；并探索DRibble与DC内质网应激之间的关系；MMSN-DRibble负载DC治疗荷瘤小鼠，具有比单独DRibble更好的抗肿瘤效应。